樱桃（Prunus mahaleb L.）PGIP基因及其启动子克隆

【摘要】： 由于PGIP能构特异性地抑制病原菌PG酶活性，因此PGIP基因在果实 病理性软化过程中起重要作用，克隆PGIP基因可用于果实采后基因工程。 果树PGIP基因的表达受乙烯、伤害、水杨酸和病原菌侵染诱导，此基因启 动子为诱导性启动子，并具有器官特异性，因此获得PGIP基因启动子，对 其克隆和测序，对研究该基因在果实成熟和软化期间表达的调控模式有重要 应用价值和理论意义。 本试验以樱桃砧木马哈利樱桃（Prunus mahaleb L.）为材料，根据Genbank 中已发表的PGIP基因序列，经同源性分析，利用其中的保守序列设计了一 对引物，首先通过RT-PCR获得了一个大约为1000bp的目的片段，经克隆 测序，证实该片段全长1045bp，包含一个完整的开放阅读框架，该阅读框架 由990碱基组成，编码330个氨基酸。PGIP cDNA序列与杏、梨、苹果的PGIP cDNA序列同源性分别达97.2％、83.4％、83.6％，PGIP基因cDNA可能编 码的氨基酸杏、梨、苹果的PGIP cDNA所编码的氨基酸的同源性分别达到 96.7％、85.2％、85.2％，说明该片段确实为PGIP cDNA序列。该序列已在 Genbank登录，登录号为AF263465。 在获得PGIP cDNA序列的基础上，本研究进一步对PGIP基因DNA序 列进行了克隆，确定内含子的位置和大小。通过对基因组DNA的PCR扩增 获得了一个大约1200bp的目的片段，并对该片段进行了克隆和测序。测序 结果表明，该片段全长1192bp，经同源性分析，该片段与杏、梨、苹果等植 物的cDNA序列同源性分别达到94.1％、82.4％和75.2％，并表明该片段可 能含有内含子。PGIP基因DNA序列和cDNA序列对比分析结果表明，在转 录过程中，除去除内含子外，未发生其它修饰；PGIP基因DNA序列中包含 两个外显子和一个内含子，两个外显子长度分别为由581、464bp，内含子较 小，全长147bp，位置在DNA序列中段。 本研究设计了一种染色体步移方法接头式嵌套PCR法用于启动子序列的 克隆，并设计了反向PCR、锚定PCR和接头式嵌套PCR引物，采用了反向 PCR、锚定PCR和接头式嵌套PCR等染色体步移方法进行了PGIP基因上 西北农林科技大学博士论文 游包含启动子的序列的克隆。实验结果表明，在三种方法中，接头式嵌套PCR 法较易获得成功。反向PCR由于步骤繁杂，很难获得大量的环状模板，扩 增较难获得成功，锚定PCR法由于筛选随机引物工作量过大，且不易获得 正确克隆，也很难获得目的片段。本研究用接头式嵌套PCR法成功的获得 了大约 2200hp的片段，该片段包含 PGIP基因部分序列及其上游序列。经克 隆测序，该片段序全长 2268碱基。经初步分析，在该片段的 19631、 距基因起始密码子 148hp处有一个 IAIA盒，在该片段的 1886q、距 起始密码子 225hp处有一个 CAAT盒，在 19lllgl6bp、CAAT盒和 IAIA 盒中间有一个G盒序列，在1251－1279、1295－1323包含一个29碱基的直接 重复序列，具备植物启动子的基本特征。 为了验证本研究中所获得的片段是否具有的启动活性，以此片段替换 PBllZI上的CaMV 355启动子，构建了此片段启动下的报告基因GUS的表 达载体，通过三亲杂交将其导入农杆菌。为了对烟草和樱桃进行转化，进行 了樱桃叶盘再生体系研究。樱桃叶盘在 MS附加 IBA3刀 m叭的培养基上可 有效生根。植腑腕记Kan的适皱择浓度为30m叭。Cef的浓度为100 一200mg／L脱除农杆菌时对叶盘生根影响较小。 用农杆菌介导法侵染烟草和樱桃无菌苗叶盘，叶盘经离体诱导分化后， 对所获得的樱桃抗性根和烟草抗性根及植株叶片用组织化学染色进行了GUS 表达检测。检测结果表明，此片段诱导了GUS基因烟草叶片和根中的表达， 在樱桃的抗性根中也能构表达。说明此片段包含启动子序列。进一步确定启 动子元件的工作正在进行中。

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