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《西北农林科技大学》 2001年
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大熊猫成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建

李煜  
【摘要】: 本项研究首先用山羊和牛的皮肤组织进行了细胞培养预备试验,对其细胞系建立方法和基 本特性进行了探讨。在此基础上,成功建立了大熊猫皮肤成纤维细胞有限和无限细胞系,获得体 外发育至囊胚的大熊猫-牛种间核移植胚胎。结果如下: 一.用含有10%NCS、100IU/ml青霉素、10OIU/ml链霉素的M199 4℃保存皮肤组织,8小 时内组织块均能存活。添加10%NCS、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素的M199、DMEM、HLH 培养液,均可用于山羊和牛的皮肤细胞的体外培养,其中青山羊皮肤组织块在上述培养液中原代 培养的成活率分别为75.0%、71.4%和80.0%。用添加D-Hanks’配制的0.25%胰蛋白酶(trypsin), 0.02%EDTA,胰蛋白酶-EDTA(0.25%胰蛋白酶,0.02%EDTA,简称TE)消化液控时控温消化,重新 接种后24小时的细胞贴壁率分别为86.4%、88.5%、95.8%。根据上皮细胞与成纤维细胞对TE消 化液的敏感度差别,经1-3次传代,可得到纯化的成纤维细胞和纯化的上皮细胞。体外传代培养 的安哥拉山羊、布尔山羊、黑白花奶牛和济宁青山羊皮肤成纤维细胞,以DMSO为冻存保护剂进 行冷冻保存,解冻培养后,24小时细胞贴壁率分别为84.2%、86.4%、89.5%和91.76%。解冻细胞 经体外3—5次传代培养,生长状态良好,细胞形态保持初始状况。 济宁青山羊皮肤成纤维细胞解冻后作为供核体,用于本实验室克隆山羊的研究,得到世界 首例成年体细胞克隆山羊,表明冻存的细胞保持了良好的遗传特性。 二.在山羊和牛皮肤细胞体外培养的基础上,对大熊猫皮肤细胞体外培养的取材、原代培养 方法、成纤维细胞纯化、培养液筛选、细胞冻存及解冻、体外生长的生物学特性等方面进行了 初步探讨,得到如下结果: 1.将大熊猫皮肤组织置含10%新生牛血清(NCS)、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素的 保存液M199中,4℃、4小时内带回实验室,用DMEM、添加水解乳蛋白的Hanks’液(HLH)和M199 基础培养基中添加10%新生牛血清、100IU/ml青霉素和链霉素,气象和温度分别为5%CO2、95% 空气、100%湿度,37.5℃进行培养,皮肤组织的成活率分别为83.3%、60.0%和77.7%。体外培 养的组织块在培养3-8天开始逸出成纤维细胞,较牛羊原代细胞迁移力强,细胞形态亦有明显区 别,成纤维细胞为多角形,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁1-3枚,大而明显。 2.0.25%胰酶-0.02%EDTA消化液控温控时消化原代细胞,经传代后可分离纯化皮肤成纤 维细胞。传代后8h细胞贴壁率为86%,24h细胞贴壁率为93%。 3.选用M199E、M199H、DMEMH、DMEML、HLH、F12为基础培养液,添加10%NCS、100IU/ml 青霉素、链霉素及5mM Hepes培养第三代皮肤成纤维细胞,在相同条件下,DMEML的效果最好。 以DMEM为基础培养液,分别添加不同浓度的血清,培养第四代大熊猫皮肤成纤维细胞,培养后 摘要 大熊猫成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建 第六天进行细胞计数,结果表明,添加 10%、15%、20%NCS对细胞生长无显著差别,无血清的DMLM 中,只能维持细胞存活,不能进行细胞增殖。以低糖DMall为基础培养液,在添加血清、双抗和 Hepes的同时分别添加不同剂量的TGF、EGP、insulin分组培养,以细胞生长群体倍增值为准, 评估生物活性因子对大熊猫皮肤成纤维细胞生长的影响。结果表明,EGF和胰岛素对细胞生长均 有较明显的促进作用。 4。用添加血清和双抗的问199为基础培养液,分别添加 fat油、10%乙二橄 10%DMSO冻 存大熊猫皮肤成纤维细胞,解冻后24小时细胞贴壁率分别为67.96%、83.33%、87.09%。添加DMSO 的冻存液效果最佳,可以满足其细胞传代和长期保存的需要。 5.以低糖DMEM为基础培养液,添加血清、HePes、双抗和sps/ml胰岛素,5$C02、饱 和湿度,37.5”C培养第三代大熊猫皮肤成纤维细胞(PF3),每天进行细胞计数,以其平均值为 准绘制生长曲线,用盖玻片培养法测定分裂指数。第六天群体倍增值为4.09。对数生长期细胞群 体倍增时间为30.28小时.六天之后,细胞增长减缓,细胞分裂指数急剧下降。生长曲线表明第 三代大熊猫皮肤成纤维细胞体外培养条件下存在延缓期和接触抑制,属正常体细胞。 6.第四代大熊猫皮肤成纤维细胞(PF4)染色体组型:Zn=42,根据着丝粒指数,总体可 将其分为两种类型,1—17号常染色体和X染色体为中部或亚中着丝粒,18----0号常染色体为小 型近端着丝粒。染色体组型分析表明体外地养的大熊猫皮肤成纤维细胞,-在传代初期保持了哀好一 的生活状态;取材、材料的保存、以及原代培养、传代培养过程中的一系列操作,不造成染色体 组型的变化。 三.用DMEM体外培养大熊猫皮肤成纤维细胞,传代到第22代时发生群体性细胞衰亡,培养 细胞增殖缓慢,传代细胞贴壁数量减少。透射电镜观察,细胞核分叶不明显,核内核仁极少并变 小,细胞质中含有较多的溶酶体及其残留物,细胞表面的微绒毛数量急剧减少,并且含有大量髓 鞘样结构。上述情况表明,此时的细胞已经发生超微结构的变化,形成
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S865.31

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【引证文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 钟华;刘中来;;大熊猫微卫星DNA的分离[A];湖北省遗传学会第七次代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年
2 傅之屏;宋曰聪;杨远兵;陈光升;王雄清;杨丽红;江跃勇;;大熊猫栖息地社区影响模型的建立与运用[A];生态学与全面·协调·可持续发展——中国生态学会第七届全国会员代表大会论文摘要荟萃[C];2004年
3 张和民;李德生;王鹏彦;张贵权;魏荣平;黄炎;周小平;汤纯香;;提高圈养大熊猫繁育力的研究[A];中国动物学会兽类学分会第六届会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年
4 杨建民;赵德明;李宁;马李颖;郝永新;秦秀慧;张磊;;大熊猫与牦牛和奶牛朊病毒蛋白全基因序列分析[A];中国畜牧兽医学会2004学术年会暨第五届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会论文集(下册)[C];2004年
5 鲁海峰;魏桂芳;赵立平;王爱善;顾建萍;金会宇;孙强;;基于ERIC-PCR的分子杂交技术对大熊猫肠道菌群结构的分析[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集[C];2004年
6 魏桂芳;鲁海峰;林志新;赵立平;;大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)肠道菌群结构分子生态学研究[A];中国畜牧兽医学会动物微生态学分会第三届第七次学术研讨会论文集[C];2004年
7 郑玉才;吕程;兰景超;王杰;李光汉;金素钰;;大熊猫初乳中酶活力和常规组成的研究[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
8 胡桂学;关振宏;夏咸柱;乔军;高凤山;逄博;;大熊猫犬冠状病毒S基因的扩增、克隆与序列分析[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
9 雍严格;杨兴中;叶新平;袁朝辉;;秦岭南坡大熊猫繁殖交配期生境选择的研究[A];中国动物学会兽类学分会第六届会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2004年
10 胡桂学;逄博;夏咸柱;高凤山;高玉伟;;大熊猫犬冠状病毒在人工感染幼犬组织中的分布[A];中国畜牧兽医学会畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学会兽医免疫分会第六次研讨会论文集[C];2005年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 林猷熙;友好使者———大熊猫[N];中国邮政报;2005年
2 吴铮;旅美大熊猫:“白云”喜得贵仔,“伦伦”玩假孕[N];新华每日电讯;2005年
3 记者 步雪琳;大熊猫保护形势依然严峻[N];中国环境报;2004年
4 记者 阴雪;北漂“无敌大熊”:明年撤出北京[N];第一财经日报;2011年
5 本报记者 钟文;大熊猫 最好的成都名片[N];成都日报;2004年
6 ;美股超级大熊市远未结束[N];21世纪经济报道;2010年
7 记者 刘妍;雅安大熊猫搭建友谊桥[N];雅安日报;2005年
8 记者 陈济朋;野生成年大熊猫现有1596只[N];人民日报海外版;2005年
9 廖文凯 张胜开 本报记者 王青山;瓦屋山:紧急营救受困大熊猫[N];四川日报;2005年
10 林文俏;基金在大熊市中扮演了什么角色[N];中华工商时报;2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李煜;大熊猫成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建[D];西北农林科技大学;2001年
2 万秋红;大熊猫保护遗传学研究[D];浙江大学;2003年
3 廖鸣娟;大熊猫等濒危动物FSH/LH和GH/GHR基因的克隆及其表达研究[D];浙江大学;2003年
4 饶刚;大熊猫和朱鹮神经营养因子基因家族的克隆、表达及活性鉴定[D];浙江大学;2003年
5 马利兵;同异种间体细胞克隆胚的体外培养及线粒体、表面抗原检测[D];西北农林科技大学;2007年
6 曹鸿国;小鼠体细胞克隆胚的ES细胞研究[D];西北农林科技大学;2005年
7 舒建洪;转t-PA基因牛胎儿成纤维细胞系的建立及转基因牛克隆胚的构建[D];西北农林科技大学;2007年
8 沈伟;ht-PAm在山羊β-casein基因座定位整合与中靶体细胞核移植的研究[D];西北农林科技大学;2004年
9 曹俊伟;人溶菌酶/乳铁蛋白双基因表达载体的构建与转基因牛克隆胚的体外发育[D];西北农林科技大学;2012年
10 王慧利;小鼠卵母细胞染色质凝集的调控及咖啡因在山羊体细胞克隆中的应用[D];山东农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 林翙;大熊猫基因组DNA文库的构建[D];浙江大学;2004年
2 张守信;PAF和PAF-AH检测对大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)早孕诊断的可行性研究[D];四川农业大学;2004年
3 郑旭;大熊猫垂体泌乳素(PRL)基因的克隆与表达[D];浙江大学;2004年
4 钟华;大熊猫非损伤性样品DNA的提取和SSR标记的分离[D];华中师范大学;2004年
5 刘春霞;马皮肤成纤维细胞体外培养与异质克隆胚构建[D];内蒙古农业大学;2004年
6 于涌鲲;四川省平武县大熊猫保护对策初步研究[D];中国林业科学研究院;2003年
7 张明;大熊猫(Ailuropoda melanoleuca )皮肤成纤维细胞系选育的初步研究[D];四川农业大学;2003年
8 范维江;大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)下丘脑cDNA 文库的构建[D];四川农业大学;2004年
9 刘磊;提高大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)初生幼仔免疫力前期研究[D];四川农业大学;2004年
10 郭海燕;人类干扰对王朗自然保护区大熊猫及其栖息地的影响[D];四川大学;2003年
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