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《西北农林科技大学》 2001年
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牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植

李雪峰  
【摘要】: 1.本研究比较了不同类型血清、不同来源的激素以及大卵泡液对牛卵母细胞体外成熟的影响。 在无大卵泡液存在时,成熟培养液中添加发情牛血清(OCS)和胎牛血清(FBS),卵母细胞的体 外成熟率显著高于添加新生牛血清(NCS)时的成熟率(83.1%,82.9%比53.0%,P<0.01);在培 养液中添加3%大滤泡液(BFF)时,OCS和FBS内卵母细胞的成熟率明显高于NCS内的成 熟率(85.1%,83.5%比57.7%,P<0.01)。结果表明:本实验条件下,OCS和FBS可以显著提 高卵母细胞的成熟率,而NCS不适合于牛卵母细胞的体外成熟;BFF添加与否不影响卵母 细胞的成熟率。在培养液中添加低纯度的FSH(10μg/ml)和LH(20μg/ml)或高纯度的 HMG(含0.075U/ml FSH+0.075U/ml LH)对牛卵母细胞体外成熟无显著的差异。 2.比较了几种不同的化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响,为体细胞核移植胚胎的激活确立 激活条件。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞,随机分为以下9组:(1).Ionomycin(I)+ DMAP(D)(ID);(2).I+D+CCB(C)(IDC);(3).I+CHX(X)(IX);(4).I+X+C(IXC);(5).7%乙醇(E)+ D(ED);(6).E+D+C(EDC);(7).E+X(EX);(8).E+X+C(EXC);(9).Sr~(2+)+C(SC)。Ionomycin和7% 乙醇处理时间为5min;DMAP±CCB处理时间为4h;放线菌酮(CHX)±CCB处理时间 为5h;Sr~(2+)+CCB处理时间为10h。体外培养24h后,前8组卵裂率在53.0%-64.6%间,大 多无明显差异,但均明显高于SC组的卵裂率(30.1%);培养36h后,各组的卵裂率分别为 72.0%、75.5%、81.3%、85.1%、81.7%、82.4%、74.4%、78.1和%51.0%;IX、IXC、ED、 EDC组卵母细胞的卵裂率明显高于ID、IDC、EX组,SC组显著低于其它各组,表明在10mM Sr~(2+)+CCB内培养10h不能有效地激活牛卵母细胞。培养到第8天时,各组的囊胚发育率分 别为18.2%、24.5%、7.2%、11.9%、11.1%、19.4%、6.7%、12.2%和2.0%,ID、IDC和EDC 组内囊胚发育率显著高于IX、IXC、ED、EX、EXC和SC组。结果表明Ionomycin与DMAP ±CCB以及7%乙醇与DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionomycin对牛 卵母细胞的激活作用比乙醇强烈;而6-DMAP的激活效果比CHX的激活效果好,激活液中 CCB的存在对孤雌生殖胚胎的发育有利。在0.2mM DMAP内培养的卵母细胞,囊胚发育率 低于2mM DMAP内培养的卵母细胞,表明低浓度的6-DMAP不能充分激活牛卵母细胞。 3.体外成熟的牛卵母细胞经5μM Ionomycin内5min和2mM 6-DMAP+5μg/ml CCB内4h 激活后,分别在TALP+M199(1∶2)(TM)、BMOC+M199(1∶2)(BM)和CR1aa内培养,24h 和36h后各组间卵裂率无显著差异;培养8天后囊胚发育率分别为18.2%、21.4%和 29.3%。孤雌激活卵母细胞在CR1aa内的囊胚发育率显著高于TM内的发育率(P<0.01), 但与BM内的孤雌激活卵母细胞间无明显差异。结果表明CR1aa和BM较适合孤雌激活 卵母细胞的体外培养,培养液中添加EGF和ICF对孤雌激活卵母细胞的卵裂和体外发育 无明显影响。Hoechst 33342染色和UV照射对孤雌卵母细胞的卵裂和体外发育产生负面 的影响,且对卵母细胞的卵裂影响尤为明显。 牛卵母细胞孤雌激活与体细胞核移植 一 4.利用常规的组织培养技术,建立了3头良种奶、肉牛耳缘皮肤成纤维细胞的传代细胞,为体 细胞核移植提供了充足的供体细胞。用含8%DMSO的血清作冷冻液,采用简化的细胞冷冻 方法冷冻保存了皮肤成纤维细胞。 5.通过电融合法或细胞质内注射法将供体细胞核移入体外成熟22~23 h去核的卵母细胞内, 重组胚经 Ionomycin和 6-DMAP(或加 CCB)激活后,转入不同的培养系统内进行培养。以牛 皮肤成纤维细胞为核供体细胞,比较融合法和细胞质内注射法进行核移植的差异,结果融合 法构建重组胚的效率显著低于细胞质内注射法;重组胚培养36 h后卵裂率相同,培养8天 后囊胚发育率无显著差异;但相对于操作的卵母细胞总数而言,前者得到的囊胚发育率显著 低于后者,表明用细胞质内注射法进行体细胞核移植效率更高。采用细胞质内注射法进行核 移植,卵丘细胞作供体时,显微操作后卵母细胞的存活率显著低于皮肤成纤维细胞做供体时 的存活率(刀.5%比87.o%);重组胚培养36 h后,前者的卵裂率显著高于后者(77.8%比7O.8%, 卜0.05):两种类型的供体细胞所构建的重组胚的囊胚发育率无显著差异(16.5%比11.9叨。 研究发现来自不同个体的皮肤成纤维细胞所构建的重组胚,卵裂率和囊胚发育率无差异。 6.应用细胞质内注射法和lonomycin与6-DMAPteCB协同激活法进行核移植,卵丘细胞作供 体时,BMM+MI99(BM)内培养的重组胚,24 h和 36h的卵裂率显著高于 TALP+M199(TM) 内培养的重组胚(58.0%比39.8o:78.6%比55.6%,
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2001
【分类号】:S823.3

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【引证文献】
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中国重要报纸全文数据库 前10条
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7 孙玉良 姚永玲;国内首例“三冻”试管婴儿在北医三院诞生[N];光明日报;2006年
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9 本报记者 吴洣麓;吴际:发现卵子再生秘密[N];北京科技报;2009年
10 记者  刘欢 通讯员  孙玉良 姚永玲;国内首例“三冻”试管婴儿诞生[N];北京日报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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3 潘登科;山头体细胞核移植(克隆)及胚胎移植的研究[D];甘肃农业大学;2002年
4 张艳玲;水牛精子胞质内显微受精的初步研究[D];广西大学;2002年
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6 路国正;波尔山羊耳成纤维细胞核移植的研究[D];山东师范大学;2003年
7 石少权;小鼠卵母细胞体外成熟培养及体外受精研究[D];重庆医科大学;2004年
8 金海霞;不同培养介质及冷冻方法对小鼠卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响[D];郑州大学;2004年
9 张清健;乙肝病毒DNA在人淋巴细胞、精子与小鼠卵母细胞中的存在与整合[D];汕头大学;2003年
10 王艾平;山羊卵母细胞冷冻保存及其效果的研究[D];第三军医大学;2005年
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