绵羊-牛种间体细胞核移植研究

【摘要】： 种间细胞核移植的研究可以揭示不同动物之间细胞核质互作的特征和规律，在实践上可以使珍稀 濒危动物的快速繁育变得可行。本试验在建立了牛卵母细胞去核、激活及细胞核直接注射法构建牛核 移植胚胎等方法的基础上，以供核细胞的处理为重点研究了绵羊皮肤成纤维细胞和牛卵母细胞之间细 胞核移植胚胎的早期发育，结果表明： 1．组织块贴附培养可以获得良好的原代绵羊皮肤成纤维细胞。发现大卵泡液以20％添加进M199培 养液，可完全取代FBS用于细胞培养，而且细胞贴附和增值效果更好。发现培养细胞的接触抑制 只是一种相对的现象，在保持培养液新鲜的情况下长期培养细胞，会出现复层生长；复层生长的 细胞不展开变形，而是相互集结成团；冷冻保存后复层生长的细胞相互集结成团的特性似乎失去， 呈分散单细胞附着于底层细胞上。复层生长的细胞接种后仍可进行良好的生长增殖。室温条件下 （20-22℃）振荡消化5min，收集脱落悬浮的细胞用于接种传代，可以明显提高细胞的存活率和增 殖能力，是收取供核细胞的适宜方法。冷冻保存的细胞解冻后平衡两次，每次30min或一次平衡 10h可显著提高细胞接种后的贴壁能力。M199培养液添加ITS，可支持细胞缓慢增殖，但不支持 细胞贴壁，配合添加BSA可以提高培养液支持细胞贴壁和增殖能力，但达不到10％FBS的效果。 2．当地屠宰场采集的牛卵巢，平均可采集7枚左右的卵丘卵母细胞复合体（COC），其中可用于成熟 培养的不足5枚；只有那些外周卵丘细胞包裹致密、卵母细胞胞质均一的卵母细胞（A、B级）才 能获得较好的成熟率和胚胎发育率。采集COC中，A、B级所占的比率越高，该批A、B级卵母 细胞的成熟率和发育能力也越高。自制发情牛血清（ECS）代替FBS和激素培养牛卵母细胞，卵 丘的扩散情况较差，卵母细胞的成熟率没有显著差异，但成熟卵母细胞的孤雌发育能力显著下降。 不管是成熟率还是孤雌发育率，mBECMaa+BSA难以取得与M199相同的效果，添加胰岛素可提 高mBECMaa+BSA成熟培养牛卵母细胞的质量。在血清存在的情况下，胰岛素添加进M199液培 养牛卵母细胞，对卵母细胞成熟率和成熟质量没有显著影响。CHX可对卵母细胞的成熟可逆性抑 制，但延迟成熟培养不能提高成熟率和发育率。 3．Ionomycin+6DMAP或乙醇+6DMAP/CHX激活牛卵母细胞的效率明显高于单独使用Ionomycin或 乙醇；Ionomycin+6DMAP比乙醇+6DMAP/CHX激活的牛孤雌胚发育更为稳定，主要表现为8/16 细胞胚到囊胚的发育率明显升高。 4．随着成熟培养时间的延长，牛卵母细胞第一极体与染色质的相对距离拉大，牛卵母细胞的去核在 成熟培养20h进行效果较好，此时有超过60％的卵中极体与染色质相连。牛卵母细胞末期去核的 成功率远大于中期去核，二者核移植胚的发育能力基本相同。牛卵母细胞在不含细胞松弛素B的 操作液中可以进行去核，但加入细胞松弛素B能明显保护核移植胚的发育能力，这种保护主要表 现在8/16细胞胚前的发育。 5．牛皮肤成纤维细胞是否进行G1/G0期同期化处理对核移植胚发育的影响不大。细胞核注射前，对 供体细胞作低渗处理能明显提高注射成功率和核移植胚的发育能力。发现供体细胞悬浮饥饿处理3 绵羊－牛种间体细胞核移植研究 天后，无需再作低渗处理即可用于注射操作，核移植胚的发育能力也有所提高，囊胚率为 15刀％。 牛体细胞核移植胚在细胞核注射前激活，还是在细胞核注射完成后激活，对其早期发育的影响不 大。 6．发现复层生长的绵羊皮肤成纤维细胞与牛卵母细胞所构建种间核移植胚的早期发育能力与贴壁生 长的细胞作供体基本相同，囊胚率分别为 10．7％、9．8％；发现绵羊皮肤成纤维细胞经含牛卵泡液 的培养液培养后，能明显提高种间核移植胚的发育能力，囊胚率 12．2％；发现牛卵母细胞内培养 增殖的绵羊皮肤成纤维细胞的种间核移植胚发育能力也明显提高，可取得 13I％的囊胚发育率。 7．还原性谷眺甘肽能明显提高 mSOFaa支持牛孤雌胚发育的能力，其效果明显优于 MI 99，也比 mBECMaa更稳定。发现FGF4也能促进牛胚胎的发育。无血清mSOFaa中加入胰岛素或FGF4能 明显提高牛核移植胚的发育能力。对mSOFaa修正后组成两组培养液ECM！、ECMZ，分步培养牛 核移植胚，可明显提高牛核移植胚的体外发育率。 8．发现卵母细胞和绵羊皮肤细胞经适宜的处理后，多枚体细胞注射进牛卵母细胞可以分裂增殖。 结论：绵羊．牛种间体细胞核移植胚在体外可以发育到囊胚；绵羊皮肤细胞用含牛卵泡液的培养液培养 或经牛卵母细胞内培养增殖后，对种间核移植胚的发育有促进作用：悬浮饥饿是卵胞质内注射用 供体细胞的适宜处理方法：＊＊MI厄＊＊2分步培养能更好的促进牛胚胎的体外发育；在适当的卵 母细胞和体细胞处理前提