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《西北农林科技大学》 2001年 博士论文
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优化三种遗传转化体系创造转抗虫基因小麦(Triticum aestivum)新种质

侯文胜  
【摘要】:小麦是世界上栽培面积最大的作物,是人类的主要食物,年产量超过5亿吨。虫害是造成作物减产的重要原因之一,小麦生产也受到如蚜虫、粘虫等害虫的严重威胁,由于在现有的小麦种质资源中几乎找不到其抗源,以及生殖隔离对异源抗性基因利用的限制,传统小麦抗虫育种收效甚微,化学杀虫剂仍是最主要的虫害控制手段,但时常由于天气的原因效果不佳,而且诸如土壤及水体污染、毒杀非靶标生物、在食物链中积累、影响人体健康等环境问题也很多。利用转基因技术,将对同翅目昆虫具有抗性的雪花莲凝集素基因gna和对鳞翅目昆虫具有抗性的苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白基因cryIA导入小麦,极有可能获得对某些害虫具有一定抗性的小麦新种质。本研究利用三种不同的遗传转化体系将gna基因和crylA基因导入了小麦,创造了转抗虫基因小麦新种质,并为改良现有小麦遗传转化体系提供了一些经验。 本研究利用在禾谷类作物中表达效率较高的启动子Ubi对现有载体进行了改造,并引入了筛选标记基因bar,为提高目的基因的表达水平,还在目的基因5’端引入了Ω和kozak序列,3’端引入了poly(A)序列。成功构建了适用于小麦的抗虫基因植物表达载体pGU4ABBar、pGU4AGBar和pGBIU4AGBar,其中pGU4ABBar含有顺向连接的Ubi-cry朋及Ubi-bar基因表达盒,pGU4AGBar含有顺向连接的Ubi-gna及Ubi-bar基因表达盒,可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化。pGBIU4AGBar含有T-DNA边界序列,并在其左右边界中间插入了含有顺向连接的CaMV35S-nptⅡ、Ubi-gna和Ubi-bar基因表达盒,不但可用于基因枪、花粉管通道法等介导的小麦遗传转化,而且还可用于农杆菌介导的小麦遗传转化。 利用农杆菌介导结合高渗预处理的方法,以扬麦158预培养一周左右的胚性愈伤组织为受体,在转化的380块愈伤组织中获得了2株导入了gna基因的转基因小麦植株,转化率约为0.5%(2/380),Southern杂交分析证明目的基因表达盒己完整整合于转基因小麦的基因组中,Western杂交分析检测到了目的蛋白的表达,同时发现适当的高渗预处理可能对农杆菌介导的小麦遗传转化系统有所改善。 利用基因枪介导法,以扬麦158预培养一周左右的胚性愈伤组织为受体,获得了2株导入了gna基因的转基因小麦,转化率约为0.3%(2/650),4株导入了cry I A基因的转基因小麦,转化率约为0.7%(4/560),Southern杂交分析证明目的基因表达盒已完整整合于转基因小麦的基因组中,Western杂交分析检测 2 优化三种遗传转化体系创造转抗虫基回小麦新种质 到了目的蛋白的表达,而且获得的转化植株都源自金粉用量较少的处理,说明在 基因枪介导的遗传转化中采用较小的金粉用量和较小的载体可能较好。 分别以小麦品系西农132和西农2208为受体,利用花粉管通道法,获得了 20株导入了gna基因的转基因小麦,转化率约为0.28O-0.840,获得了27株导 入了cry/A基因的转基因小麦,转化率约为1.13%-l.ZI%,并得到了huthern 斑点杂交的确证,酶切Southern杂交分析证明目的基因表达盒己完整整合于转基 因小麦的基因组中,Western杂交分析检测到了目的蛋白的表达,分子检测及目 的基因表达蛋白检测结果的获得,为正确估价花粉管通道法在小麦遗传转化中的 地位进一步提供了证据。 本研究获得的转抗虫基因小麦植株可进一步用于小麦抗虫新品系的选育。


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