表达两种不同外膜蛋白的禽大肠杆菌融合株的构建及初步应用

【摘要】：对从陕西省主要养鸡地区病死鸡及鸡胚中分离的主要血清型致病性禽源大肠杆菌，采用超声波裂解和N-十二烷酰肌氨酸进行外膜蛋白（Omp）的提取，用SDS-PAGE进行Omp分型，结果18株菌共出现了3种Omp型，其中4株O1，4株O2，4株O78和3株O89均具有2个Omp型（Omp1，2型），3株O75出现了3个Omp型（Omp1，2，3型），说明不同血清型间有共同Omp型，而相同血清型间Omp型可以不同。 采用不同浓度和不同作用时间溶菌酶裂解细胞壁，制备原生质体，在高渗平板上再生培养，选择原生质体形成和再生的最佳条件为酶浓度6mg/mL作用时间25min；在药敏实验基础上，结合Omp型分析，选择具有交叉耐药且Omp型不同的菌株，利用PEG诱导进行原生质体融合，在含双抗的高渗平板上筛选融合株，对不同代次的融合株分别进行革兰氏染色镜检、生化鉴定、血清型鉴定和Omp型分析，结果表明，染色镜检和生化特性均符合大肠杆菌特征；75%融合子可凝集两亲本的O抗原，25%凝集其中一个亲本的O抗原；外膜蛋白型表现为一个或两个亲本的带型，但都有不同程度的增强。经稳定性检验证明其为遗传学上稳定的融合子。 用制备的融合株作为制苗菌制备E.coli铝胶苗，免疫动物后，通过抗体水平测定和攻毒实验，与单价苗比较评定融合株疫苗的免疫效果。结果表明：融合株疫苗免疫后的抗体水平与抗体消长规律与单价苗基本相同，但融合株疫苗对不同血清型E.coli混合攻毒的保护率比单价苗和对照分别提高了13%~33%和60%~66%，说明表达两种不同外膜蛋白的融合株疫苗的抗原谱更广，保护力更强。