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《西北农林科技大学》 2001年
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白菜类蔬菜叶球发育相关基因的分子克隆及其转基因植物研究

薛万新  
【摘要】: 根据大白菜BcpLH基因设计一对引物,以小白菜基因组DNA为模板,进行BcpLH同源基因扩增,扩增产物命名为BccLH基因。从基因组、cDNA、氨基酸、蛋白质结构等多个方面比较了大白菜BcpLH基因和小白菜BccLH基因的差异。BccLH基因序列全长为1544bp,与大白菜BcpLH基因序列同源性96.1%。Southern杂交结果显示,小白菜基因组中只有1个拷贝的BccLH基因。该基因与大白菜中BcpLH基因一样,也包含2个内含子和3个外显子,BccLH基因与大白菜BcpLH基因比较,第三个外显子的基因序列存在较大的差异,发生多处碱基替换或者缺失,尤其是在ATG下游1427-1448bp处,有连续21个碱基缺失(对大白菜而言),在其它三个位置还分别有1、2、3个碱基缺失。此外,第三个外显子内共有28处发生了碱基替换。序列其它位置则相对保守。因此,小白菜与大白菜在结球性状上的差异很可能是由于第三个外显子内碱基的这种变化引起的。 BccLtt基因的cDNA序列为一全长cDNA,读码框包含852个碱基,比大白菜多出27个碱基。该cDNA与大白菜BcpLH基因cDNA同源性分别为93.3%,由BccLtt基因cDNA推导的氨基酸序列全长为283个氨基酸,比大白菜多9个氨基酸,其中从第248个氨基酸处开始,大白菜出现有7个连续的氨基酸序列缺失,即-P-E-N-A-E-T-M,此外,在其它一些位置还有12个氨基酸代换和2个氨基酸插入。两个基因的蛋白质序列之间的同源性为92.9%。通过数据库进行同源性比较,除了大白菜和结球甘蓝以外,还没有发现与BccLH基因高度同源的已知基因。但与大白菜一样,BccLtt基因的多肽链中有2个片段与双链RNA结合结构域(DRBM)一致,只是在第二个片段存在有一个氨基酸的差异。BccLH的两个DRBM与人类RNA结合蛋白TRBP的对应区域分别有51%和59%的一致性。BccLH基因的蛋白质二级结构与BcpLH基因蛋白质二级结构在第250个氨基酸之前完全一致,此后存在一定的差异。这也可能是导致大白菜与小白菜在发育过程中产生不同发育方向的重要原因之一。 根据BcpLH同源cDNA序列的同源性绘制了大白菜、小白菜、油菜、拟南芥、甘蓝、水稻等6种作物的8个同源基因的进化树。进化树与普通植物学分类基本一致,并从分子水平上揭示了它们的进化和分类关系。 通过非组织培养遗传转化方法将BcpLH正义基因和BcpLH反义基因分别转入小白菜和大白菜,研究BcpLH基因对叶球形态发生的调节功能。大白菜通过真空抽滤法转化频率达到0.63%;小白菜子房注射法转化频率达到1.8%。组培法初步筛选的抗性苗切去基部后,在MS+NAA0.5mg/L的培养基上可实现大量生根,生根苗移栽成活率大大提高。采用水培法筛选, 西北农林科技大学博士学位论文2 并通过移栽后复选是一个较好的筛选方法,该法操作简便,单位时间筛选种子数多,筛选效率高。 水培法筛选大白菜转化体时,卡那霉素适宜的浓度为 50ug/thl,小白菜为 40Ug/llil。所得抗性苗中 7株经分子检测,有4株被确定有外源基因的导人。转p正义基因大白菜有提早提早包0的 趋势,其性状有待进一步观察。转BoLH反义基因大白菜出现先期抽至变异。转正义基因小白菜 无明显表型变化。 大白菜原位真空抽滤法遗传转化影响因素的研究表明,初花期的转化频率最高。大白菜种于 经过 2℃低温处理 20天,并于 12月 8日播种,60天后可建成原位真空抽滤转化的适宜苗态。大 白菜和小白菜经2M305断续抽滤,转化频率相对较高。不同的菌液浓度处理间抗性苗获得率无 明显规律。真空抽滤转化中,渗人培养基中蔗糖是必需的,浓度为5%时转化频率最高。表面活 性剂 Silwet L-77对转化频率有较大的影一,渗入培养基中用 0.02%Silwet L-77与 5%蔗糖配合, 转化频率达2%。28℃转化效果明显优于20℃。去顶苔处理、重复抽滤等对转化频率的影响不大。
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