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mtlD/gutD双价耐盐基因转化杨树、猕猴桃的研究

樊军锋  
【摘要】: 我国“三北”及沿海地区有大量盐碱地。随着工业迅速发展、人口猛增和可耕地面积的减少,培育抗盐植物材料,开发利用盐碱地显得日益重要。 杨树为“三北”地区主要人工造林树种,栽培数量很大;猕猴桃为一新兴果树,经济价值较高。提高这2个树种抗盐性,扩大其栽培区域是开发利用盐碱地的有效途径,具有重要的生产意义。 本实验计划通过将mtlD/gutD双价耐盐基因导入杨树、猕猴桃,来提高这2个树种的抗盐能力。转化方法以叶盘法为主,辅助使用了基因枪法。所用植物双价双元表达载体为pBIMG,其上含有双价抗盐基因mtlD/gutD、双重增强的35S启动子和TMV“Ω”片段的翻译增强子及NPT-Ⅱ卡那霉素抗性标记基因,农杆菌菌株为LBA4404。杨树选用“三北”地区栽植数量较多的美洲黑杨×青杨杂种,猕猴桃选用经济价值较高的秦美猕猴桃。主要研究内容如下。 1利用正交等实验设计开展了杨树、猕猴桃叶片外植体高效再生系统建立研究。通过系统实验,筛选出杨树叶片外植体不定芽诱导最佳配方为MS+6-BA0.5mg/L+NAA 0.01mg/L,不定芽生根诱导最适配方为1/2MS+NAA 0.01mg/L;猕猴桃叶片外植体不定芽诱导最佳配方为:MS+6-BA 6mg/L+NAA 0.1mg/L,不定芽生根诱导最适配方为:1/2MS+NAA 0.01mg/L+IBA 0.5mg/L+GA 1mg/L。 2通过卡那霉素敏感实验,确定了杨树叶片不定芽诱导卡那霉素临界敏感浓度为50mg/L,不定芽生根诱导卡那霉素临界敏感浓度为60mg/L;秦美猕猴桃叶片不定芽诱导卡那霉素临界敏感浓度为50mg/L,不定芽生根诱导卡那霉素临界敏感浓度为40mg/L。 3利用叶盘法开展了mtlD/gutD双价耐盐基因转化杨树的研究。经叶盘不定芽诱导及不定芽生根诱导阶段卡那霉素连续筛选,获得了38株生根卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR检测,28株呈阳性。对其中7株阳性植株进行southern及Western杂交,有4株二者均呈阳性,确证双价耐盐基因成功整合到杨树基因组中并得到表达;利用叶盘法和基因枪相结合的办法,开展了mtlD/gutD双价耐盐基因转化猕猴桃的研究。获得卡那霉素生根抗性植株20株,其中6株经PCR检测呈阳性,初步证明双价耐盐基因转化获得成功。 4开展了转基因植株耐盐性测定。结果表明,杨树未转基因植株NaCl最高耐受浓度为0.2%,4株转基因植株抗NaCl能力最低为0.4%,最高达0.6%,比对照有较大幅度提高;猕猴桃未转基因植株NaCl最高耐受浓度为0.1%,6株PCR阳性植株中,2株抗NaCl能力与对照一致(为0.1%),推测为假阳性,另4株NaCl耐受浓度为0.2~0.4%,比对照有不同程度提高。 2 milD/gutD双价耐盐基因转化杨树、猕猴桃的研究 本实验在建立了杨树、猕猴桃叶片外植体高效再生系统及确定了卡那霉素耐受浓 度的基础上,利用叶盘法、叶盘法和基因枪相结合的办法分别开展了milD哈utD双价 耐盐基因转化杨树和猕猴桃的研究。经PCR、Southern及Western杂交检测,确证 milD哈utD双价耐盐基因成功整合到4株杨树基因组中并得到表达。同时,PCR检测 也初步证明部分猕猴桃植株转化获得成功。耐盐测定表明转化植株耐盐性比对照均有 不同程度提高。这在杨树、猕猴桃耐盐基因工程研究中尚属首次。


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