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鸡传染性支气管炎病毒LX4株主要结构基因的研究

贺秀媛  
【摘要】: 细菌、病毒等所产生的生物性毒物对机体的代谢、繁殖机能有着重要的影响,目前对细菌毒素的研究比较透彻,已经上升到分子水平,特别是通过病原微生物全基因组序列的测定,使人们从更高层次上把握病原微生物的致病机理及其规律成为可能。到目前为止,已完成了近10个细菌全基因组序列的测序工作,更多细菌的全基因组序列正在进行中。细菌全基因组序列测序工作的完成将给人类分析和研究编码细菌毒性蛋白的毒力基因、认识和阐明毒性蛋白的毒理带来新的机遇。而对病毒这方面的研究相对滞后,为了探讨病毒对细胞、组织的毒性作用及其毒理,分析病毒基因组中主要结构基因在致病和免疫中的功能,研制阻断病毒与细胞融合的药物及其有效的疫苗,为其防制提供全新的思路,就必须以基因组的分析为基础。本研究首先分离鸡传染性支气管炎病毒我国地方流行毒株(IBV-LX4),然后进行形态学和生物学特性的鉴定并进行蚀斑纯化。在此基础上,根据国内外已发表的IBV基因序列,分别设计特异性引物,应用不同引物进行反转录合成cDNA,分片段对IBV的主要结构基因进行PCR扩增,并分别将各个目的片段克隆到pUC19载体上,在大肠杆菌DH5α中实现目的基因的分子克隆,经蓝白斑筛选、限制性内切酶分析、PCR鉴定,筛选出重组阳性质粒,并对各个目的基因片段进行序列测定,从而获得IBV主要结构基因全序列。通过计算机分析软件,对我国IBV地方流行毒株LX4的主要结构基因全序列、分子特征及遗传变异进行分析比较,并初步分析预测传染性支气管炎病毒主要结构蛋白上可能存在的T细胞和B细胞表位。实验结果表明: 1.生物学特性:鸡胚尿囊液经离心、磷钨酸负染后,电镜观察该病毒为典型的冠状病毒;该毒株的第一代尿囊液对鸡胚无肉眼可见的致病作用,当继代到第5代后,胚体严重病变;病毒在鸡胚中随着接种时间的延长,其效价增高,96h可达到48h的2倍;该毒株可在CEF上生长,但不能形成明显的蚀斑;经1%胰酶处理后可凝集鸡红细胞;鸡胚的第四代尿囊液病毒回归动物体,病死鸡肾脏呈典型的花斑肾,腺胃则未见肉眼可见的病变。证明分离到的病毒为鸡传染性支气管炎病毒。 2.S1基因:其全序列共1614bp(从起始密码子ATG到S前体蛋白裂解位点),编码537个氨基酸,其氨基端有一编码18个氨基酸的信号肽序列,第12~13位氨基酸残基构成了信号肽的切割位点,14~19位与111~124位氨基酸残基为S1蛋白的跨膜区域。S1蛋白中含有19个高度保守的潜在的糖基化位点及17个半胱氨酸。同源分析结果显示不同毒株S1基因均存在基因缺失、基因替换和基因插入等变异现象。S1基因除与QX的亲缘关系较近外,与其它参考株的同源率均低于80%,可能为一株国内流行性的变异株。 3.S2基因:核苷酸序列全长2023bp,编码625个氨基酸,包含完整的阅读框架, 其中SZ C端约560—595位之间的35个氨基酸高度疏水,216~232位氨基酸残基与 412~417位氨基酸残基为其另外的两个跨膜区。SZ基因序列中含有 19个半肤氮酸, 13个糖基化位点。在 SZ与 SI交界处的切割序列为 HANRR。SZ N端第一个氨基酸 为色氨酸(Ser),C端 560~587为一山正电荷组成的区域,古有两个长的 a-螺旋。 SZ较为保守,其变异主要表现为点突变,且C端比N端的保守程度更大。与其他毒 株之问核昔酸序列的同源性为幻%-引%,氨基酸序列的同源率为86%~N%。 4.A/I基回。序列全长678hi,,编码:125个氨基酸,包含完整的阅读框架,含有两 个糖基化位点,9个高度保守的半肤氨酸,25~35位、52~95位之间的氨基酸残基 为其两个跨膜区域,35~45位与88~98位之间的氨基酸残基为其两个信号肽,41 位、92位氨基酸处为信号肽的切割位点。问源分析发现不问毒株间M基因存在着缺 失、插入、及点突变等变异现象,且5”末端易发生变异,3”木端较为保守;与其他 毒株 IBV M 基因核昔酸序列的同源性为 85%-100%,氨基酸序列的同源性为 83%~100?/o。 5.N基因:全序列为1230hp,编码409个氨基酸,包含完整的开放阅读框架。 其变异主要表现为基因缺失、基因替换和基因插入,且变异没有集中区域的高变区。 与其他毒株间(除V18/91外)核昔酸序列的同源性为85%~99%,氨基酸序列的同源 率为83%~91%。 综合以上实验结果,本实验得出以下结论: l)生物学实验证实国内地方分离株 I.X4为鸡传染性支气管炎病毒。 幻首次克隆并测定了我国地方分离株LX4的主要结构基因核合酸序列,实验证 实编码纤突蛋白巧)、膜蛋白 *)和核蛋白*)的基因均存在基囚插入、缺夫与 点突变现象,而SZ基因仅表现为点突变。 3)各结构基因的变异程度不同,纤突蛋白SI基因的变异最大,纤突蛋白SZ的 变异次之,膜蛋白基因最为保守,其N端前42位氨基酸较易变异,C端更为保守。 核蛋白中间比两端保守。基于SI基因高变区(前500m)。整个引基因、N基因的基 因分型结果是一致。 4)LX4株纤突蛋白裂解位点处氨基酸的组成为 Hll]ll;UI,这种序列的毒株不同于 已报道的其它传染性支气管炎病毒。 引首次预测了其主要结构蛋白


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