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秦川牛皮肤细胞的分离与体外培养

秦粉菊  
【摘要】: 本试验应用细胞培养技术,研究了秦川牛皮肤组织细胞的分离及原代培养方法;首次建立了秦川牛皮肤上皮细胞和成纤维细胞系;并对成纤维细胞的生长特性进行了深入探讨,结果表明: 1.组织块法、分散单细胞及Dispase冷消化法单细胞均能获得好的秦川牛皮肤组织原代培养物。其中150IU·mL~(-1)胶原酶I与0.05%胰蛋白酶(1:1)同时应用能更好的分离秦川牛皮肤组织,是获得秦川牛皮肤细胞的适宜方法。 2.与添加EDTA相比,用只含胰蛋白酶的Hanks'液处理贴壁细胞,所回收的传代细胞存活能力较好;而添加EDTA的胰蛋白酶消化液消化能力较强。 3.对于秦川牛皮肤上皮细胞与成纤维细胞的纯化:Dispase冷消化单细胞培养的效果最佳,可获得纯化的上皮细胞系,而根据二者对胰蛋白酶的敏感性不同的分离方法、反复贴壁法适宜于获得纯化的成纤维细胞系。 4.秦川牛皮肤成纤维细胞在低糖DMEM、TCM199及1:1的DMEM+F_(12)培养液中均能够比较好的生长增殖,但以低糖DMEM的效果最好。 5.在低糖DMEM中添加EGF和IGF_(-1)均可以对秦川牛皮肤成纤维细胞增殖能力的提高有显著效果,其中IGF_(-1)促增殖作用稍强于EGF,且二者具有协同作用。 6.从生长曲线可以看出,以低糖DMEM培养第4代秦川牛皮肤成纤维细胞,接种后滞留期缩短,约一天左右,之后为对数生长期,持续六天左右,进入平顶期。分裂指数最高时期在培养开始后的第五天,第六天急剧下降。上述两种指标说明第四代秦川牛皮肤成纤维细胞体外培养条件下存在早期生长延缓和接触抑制,属正常细胞。 7.染色体检查表明:第八代秦川牛皮肤成纤维细胞仍然保留着染色体数目的完整性。


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