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《西北农林科技大学》 2002年
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间充质干细胞向神经细胞分化的研究

侯玲玲  
【摘要】: 间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是继造血干细胞之后近年研究较多的另一类组织干细胞。目前发现骨髓、脐带血、关节滑膜、胎儿血液和肝脏以及胎儿、成人、老年人骨骼肌和皮肤的结缔组织内均存在具有多向分化潜能的MSC。本论文主要研究了人骨髓和脐带血来源的MSC体外分离、扩增、定向诱导以及在动物体内的迁移和分化,为MSC的临床应用提供了理论依据和技术方法。 1.骨髓MSC是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞,体外不仅可以分化为间充质类细胞,而且可以分化为非间充质类细胞。本研究探讨了人骨髓MSC的体外分离、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件。无菌条件下采集正常人的骨髓,用相对密度1.073g/mL的Percoll分离液分离骨髓中的单个核细胞,进而获得MSC。用MesenCult~(TM)培养基进行纯化和扩增培养。5.0×10~5个原代细胞体外扩增12代后获得2.3×10~9个细胞,扩增约4.6×10~4倍。流式细胞仪检测结果显示,骨髓MSC不表达CD34、CD11a,强表达CD29,弱表达CD71。诱导扩增第2、6和10代的骨髓MSC向神经细胞分化,诱导后的细胞平均有80%以上呈现典型的神经元表型。免疫组化法检测发现这些神经细胞强表达神经丝蛋白(neurofilament,NF)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE):组织化学法检测可见神经元特有结构尼氏体。这表明骨髓MSC在体外能够迅速扩增,并具有向神经细胞分化的潜能。 2.脐带血中也存在MSC。本研究探讨了人脐带血MSC的体外分离、纯化、扩增和向神经细胞的定向诱导分化条件。无菌条件下采集肝素抗凝的正常人脐带血,用相对密度1.077g/mL的淋巴细胞分离液分离脐带血中的单个核细胞,进而获得MSC。用MesenCult~(TM)培养基进行纯化和扩增培养。6.6×10~5个人脐带血原代MSC在体外扩增10代后获得9.9×10~8个细胞,扩增约1.5×10~3倍。用流式细胞仪检测MSC的表面标志结果显示,脐带血MSC不表达CD34、CD11a和CD11b,强表达CD29,弱表达CD71,与骨髓MSC表面抗原特性一致。取扩增第2、5和8代的MSC分别向神经细胞诱导,诱导后的细胞平均有70%左右呈现典型的神经元表型,免疫组化法检测发现不同代数的MSC诱导后均表达NF和NSE;组织化学法检测可见神经元特有结构尼氏体。这表明脐带血MSC在体外同样能够迅速扩增,并具有向神经细胞分化的潜能。 3.为了探索MSC向神经细胞分化过程中的路径,本研究利用RT-PCR技术检测了诱导前后的细胞对神经干细胞特异性标志Nestin的表达。结果发现诱导前的MSC不表达Nestin,诱导5h后的细胞表达Nestin,表明MSC经神经干细胞向神经细胞分化。 4.为了进一步探讨诱导后的神经细胞是否具有生理功能,本研究利用膜片钳技术 VI 间充质干细胞向神经细胞分化的研究 对诱导后的细胞进行全细胞记录。结果表明,钾通道电流大多具有激活缓慢的特点; 另外,经过检测发现其还具有外向整流特点,这与神经元具有的延迟整流性钾通道电 流相似。 5.MSC是细胞治疗和基因治疗的种子细胞之一。为了探索MSC在体内的迁移和 分化趋势,为帕金森病(Parkinson disease,PD)的干细胞治疗提供理论和实验依据, 本实验将体外扩增并转染增强型绿色荧光蛋白knhanced green luorescent protein, EGFP)的人骨髓MSC注入PD大鼠脑内纹状体,观察了人骨髓MSC在大鼠脑内的 存活、迁移、分化以及注射MSC前后大鼠的行为变化。结果表明,人骨髓MSC在大 鼠脑内可以较长时间存活(十周以上\ 随着时间的延长,MSC迁移范围扩大,分布 于纹状体、脐氏体、皮质以及脑内血管周围;其中部分细胞可能分化为血管内皮(从 位置和形态推测),这可能与组织修复过程中血管再生活跃有关。兔疫组化法检测发 现MSC在大鼠脑内表达人NF、NSE以及胶质原纤维酸性蛋白哈lial ibrillny acid p耐h,*FA P人而且PD大鼠的异常行为有所缓解,转圈数由8.86士2刀9帅In 下降 到4.87士又刀6咖In,差异显著o<0刀5人表明植入的骨髓*SC在脑内微环境的作 用下能够在一定程度上发挥作用,有望成为治疗PD的种子细胞。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:Q25

【引证文献】
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【参考文献】
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