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《西北农林科技大学》 2002年 硕士论文
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小白菜植株原位真空渗入遗传转化体系的研究

宋正旭  
【摘要】: 本研究以三个品种小白菜(Brassica campestris L.ssp.chinensis var communis Tsten et Lee)为材料、在两个菌株LBA4404(携带nptⅡ基因和gus基因)和GV3101(携带Bari-1基因和hpt基因)介导下,重点研究了植株原位真空渗入遗传转化体系,包括适宜苗态的建成方法研究、转化影响因素研究、转化体筛选和转化机理初步研究四部分。另外,初步探讨了用浸花方式进行遗传转化的方法。试验结论如下: 1.通过自然春化和种子人工低温处理两种途径对适宜苗态建成方法的研究表明:自然春化条件下,杨凌地区秋季9月7日是三个材料形成最佳适宜苗态的播期;春季2月17日是上海青和黄心乌形成适宜苗态的播期。而种子人工低温处理中,0~4℃下,上海青17d,黄心乌25d,四月慢29d,同时7~9℃下,黄心乌25d,皆能形成适宜苗态。以上途径相比前者相对较好,但后者也不失为一种较好的方法。 2.影响转化诸因素的研究表明:(1)外源基因向黄心乌转化的效率明显高于其他两个品种;(2)菌株LBA4404介导转化的效率比GV3101高:(3)渗入培养基中添加AS对转化率影响不明显,将Ca~(2+)浓度提高到0.1mol/L转化率为0;(4)真空渗入时间黄心乌以1min+间歇30S+30S为佳,上海青和四月慢为2min+间歇30S+30S为佳;(5)打主薹后10d的植株比其他时期的转化率高;(6)植株大小对转化率影响不大;(7)植株在真空渗入前经0~4℃低温处理7小时转化率高于对照。 3.三个材料抗生素抗性试验结果表明:鉴别转化体的标准为植株生长正常,叶片绿色,有侧根发出或真叶长出或既有真叶长出又有侧根出现。用潮霉素筛选上海青转化植株时,最佳浓度为30mg/L,筛选黄心乌和四月慢转化植株时,最佳浓度均为50mg/L;用卡那霉素筛选三个材料转化植株最佳浓度为50mg/L;筛选的的最佳时间是从培养基播种后第20天开始。 4.分别用真空渗入处理植株和未处理植株作父、母本和母、父本进行杂交,以真空渗入处理植株自交作对照,对转化机理进行了初步研究。结果表明花粉和胚珠皆可作为外源基因的最初受体。 5.将处于盛花期的黄心乌植株浸入农杆菌渗入菌液中进行转化,初步研究了浸花法。结果表明浸花5min和10min都能得到卡那霉素抗性植株,但浸花10min转化率低于浸花5min。 6.本研究共得到了卡那霉素抗性植株170株,潮霉素抗性植株67株。从卡那霉素抗性植株中随机抽取15株进行PCR检测,其中8株出现了目标条带。扩增结果初步说明外源基因已整合到植物基因组中。


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