收藏本站
《西北农林科技大学》 2003年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

疫病(Phytophthora cinnamomi)pg基因的克隆、测序及其遗传转化研究

巩振辉  
【摘要】: 在研究优化克隆Pcpg1、Pcpg2、Pcpg4、Pcpg6、Pcpg7、Pcpg9、Pcpg10、Pcpg12、Pcpg16、Pcpg17、Pcpg19、Ppgip和AnpgⅠ基因或基因片段(外含子)PCR条件的基础上,以Phytophthora cinnamomi基因组DNA或质粒DNA为摸板,对上述基因或基因片段进行了克隆、测序与分析、连接及构建了它们的表达载体;利用酵母菌遗传转化方法,将各个目的基因导入了酵母菌菌种W303-1B;应用Western blotting技术和PG活性检测方法研究和分析了目的基因的表达;对不同pg基因的表达与A Pgip、T Pgip和P Pgip基因的表达的相互作用进行了初步研究。同时,对Pg基因诱导表达的时间与方法进行了试验分析,并研究规范了大肠杆菌菌落PCR和酵母菌菌落PCR的技术与方法。获得了以下主要结果: 1.构建了Pcpg1、Pcpg2、Pcpg4、Pcpg6、Pcpg7、Pcpg9、Pcpg10、Pcpg12、Pcpg16、Pcpg17、Pcpg19和Ppgip基因的表达载体。该表达载体是在pYES2酵母菌表达载体的基础上改建的,它包含半乳糖诱导启动子序列、氨苄青霉素抗性基因序列、尿嘧啶基因序列、2μ复制起始点序列及一由α因子前体蛋白序列、Kex2酶切位点序列和3×HA肽链标记序列组成的大小为363bp的复合序列,可使PG高拷贝复制并被分泌表达。经菌落PCR检测和酶切分析表明,所构建的不同基因表达载体完全符合设计要求,可用于遗传转化研究。 2.优化获得了克隆Pcpg1、Pcpg2、Pcpg4、Pcpg7、Pcpg10、Pcpg19和Ppgip基因及克隆AnpgⅠE1、AnpgⅠE2、AnpgⅠE3、Pcpg6E1、Pcpg6E2、Pcpg9E1、Pcpg9E2、Pcpg12E1、Pcpg12E2、Pcpg16E1、Pcpg16E2、Pcpg17E2和Pcpg17E3外显子的PCR反应条件。序列分析表明,克隆上述基因或外显子的PCR反应条件为最适PCR反应条件,可用于上述基因或外显子的克隆及其研究。 3.序列分析和遗传转化表达研究明确了11个Pcpg基因和Ppgip基因的大小,其中Pcpg1、Pcpg2、Pcpg4、Pcpg6、Pcpg7、Pcpg9、Pcpg10、Pcpg12、Pcpg16、Pcpg17、Pcpg19和Ppgip基因的大小分别为1011bp、1011bp、1011bp、1017bp、1170bp、1059bp、1290bp、1293bp、996bp、996bp、1146bp和1026bp。 4.通过比较所克隆基因的序列结果与基因组文库机读结果,进一步明确了Pcpg1、Pcpg2、Pcpg4、Pcpg6、Pcpg7、Pcpg9、Pcpg16、Pcpg17、Pcpg19和PPgip基因的序列;更正了基因组文库机读结果,其中Pcpg10的第390个氨基酸——丙氨酸A(GCC)应为甘氨酸G(GGC),Pcpg12的第219个氨基酸——亮氨酸L(TTG)应为苯丙氨酸F(TTC)。这一结果为这些基因的正确登录奠定了基础。 5.获得了转化Pcpg1、Pcpg2、Pcpg4、Pcpg6、Pcpg7、Pcpg9、Pcpg16、Pcpg17、Pcpg19和Ppgip基因的菌系。PG活性测定表明,转化Pcpg2、Pcpg4、Pcpg6、Pcpg7、Pcpg9、Pcpg10、Pcpg12和Pcpg17基因的菌系表达PG活性,是有功能的基因;而 疫病(尸勺toPhthom cinnam。脚i)Pg基因的克隆、测序及其遗传转化研究 转化尸以瞥1沪以啥16和尸邵茗19基因的酵母菌未表达PG活性,是无功能的基因,Westem blotting结果表明,尸以心1、尸印916和尸邵啥19基因能指导合成相应的分泌蛋白质,显 而己见,尸印91、尸印916和pcPglg基因所指导合成的分泌蛋白质是没有PG酶活性 的。不同的Pg基因表达的PG酶活性强弱有差异,转化尸印92、尸印97和尸印910基 因的酵母菌所分泌的PG酶活性最强,转化A那瞥I、尸以啥4、尸印912和尸以啥17基因 的酵母菌所分泌的PG酶活性次之,转化尸印96和尸邵心9基因的酵母菌所分泌的PG 酶活性最弱。 6.诱导Pg基因表达的适宜时间是4小时。转化Pg基因的菌系所合成的PG全 部分泌在培养液,细胞内不含PG酶。 7.Westem blotting结果表明,所有供试转化的n个尸cPg基因的菌系均出现了 大小不同、深浅不一、连续的多条印迹带,这一结果说明PG的糖基化是一个普遍现 象。 8.PG与PGIP相互作用的初步研究表明,APGIP、TPGIP和PPGIP对ANPGI 和供试的PCPG均没有抑制作用。 9.规范了大肠杆菌菌落PCR和酵母菌菌落PCR技术。将菌落PCR技术应用于 基因克隆和遗传转化可显著提高其效率。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:S432

手机知网App
【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 韩长志;;樟疫霉(Phytophthora cinnamomi)的研究进展[J];南京林业大学学报(自然科学版);2012年04期
【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 段学武,张昭其,季作梁;PG酶与果实的成熟软化[J];果树学报;2001年04期
2 余永年;李金亮;杨雄飞;;中国橡胶树疫霉种的研究[J];真菌学报;1986年04期
3 张开春,张军科;马哈利樱桃PGIP基因克隆及全序列测定[J];农业生物技术学报;2000年03期
4 郑远旗,杨宗剑,李建吾,周立,吴文莲,余露;小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离纯化研究[J];生物化学与生物物理学报;1994年05期
5 鞠戎,田颖川,沈全光,刘存德,莽克强;番茄多聚半乳糖醛酸酶cDNA的克隆及其对番茄中PG表达的反义抑制[J];生物工程学报;1994年02期
6 李惠,肖璐,祝建波,崔百明,乐锦华,曹连莆;加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆[J];石河子大学学报(自然科学版);2000年03期
7 马庆虎,宋艳茹,魏玉凝,李跃东,侯林林;多聚半乳糖醛酸酶反义基因在转基因番茄中的表达[J];生物多样性;1995年01期
8 李惠,肖璐,祝建波,高丽娜,乐锦华,曹连甫;加工番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因的cDNA克隆和全序列测定[J];生物技术;2001年02期
9 朱广廉;果实成熟的基因工程研究[J];生物学通报;1995年11期
10 常彩涛,巩振辉,王鸣;陕西辣椒疫病菌种的鉴定[J];西北农业学报;1993年01期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 薛炳烨,束怀瑞;应用基因工程改良果实成熟特性研究进展[J];山东农业科学;2002年04期
2 李刚;柳中海;单春会;;水杨酸处理对哈密瓜生理指标影响的研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2009年11期
3 王春笛;杨素祥;郝大海;李灿辉;;马铃薯晚疫病菌交配型研究概述[J];安徽农学通报(上半月刊);2010年13期
4 戚仁德,丁建成,顾江涛,高智谋,岳永德;辣椒疫霉抗甲霜灵菌株的致病力研究[J];安徽农业科学;2001年02期
5 钱玉梅,高丽萍,王旭侠;草莓采后贮藏保鲜技术[J];安徽农业科学;2004年01期
6 王英超;张桂霞;赵汐琼;李天俊;;柿果软化过程中α-淀粉酶活性与Cx纤维素酶活性变化研究[J];安徽农业科学;2007年28期
7 戚仁德;汪涛;李萍;丁建成;;辣椒疫霉抗甲霜灵菌株若干生物学性状的无性遗传研究[J];安徽农业科学;2008年13期
8 罗爱民;张进忠;李坤;简力波;;不同处理对水蜜桃果实PG酶动力学影响的研究[J];安徽农业科学;2009年08期
9 张弢;;芥蓝BoPGIP2全长基因的分子克隆及其序列分析[J];安徽农业科学;2009年32期
10 谌悦;张军科;熊帅;;桃PGIP基因及cDNA的克隆及序列分析[J];安徽农业科学;2009年32期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 丁建成;戚仁德;倪春耕;顾江涛;;辣椒疫霉对甲霜灵的抗药性风险及治理对策[A];现代农业理论与实践——安徽现代农业博士科技论坛论文集[C];2007年
2 傅明连;林素英;蔡丽琴;黄志明;吴锦程;;不同枇杷品种细胞壁代谢与果肉质地形成的关系[A];第五届全国枇杷学术研讨会论文(摘要)集[C];2011年
3 唐庆华;宋薇薇;余凤玉;朱辉;牛晓庆;韩超文;吴多扬;覃伟权;;散尾葵叶枯病病原鉴定与生物学特性研究[A];植保科技创新与病虫防控专业化——中国植物保护学会2011年学术年会论文集[C];2011年
4 余文贵;赵统敏;高军;;生物技术在番茄品种改良中的应用[A];中国科协第3届青年学术年会园艺学卫星会议暨中国园艺学会第2届青年学术讨论会论文集[C];1998年
5 徐昌杰;胡桂兵;张上隆;;果实成熟特异启动子研究进展[A];中国园艺学会第五届青年学术讨论会论文集[C];2002年
6 李锡香;;中国蔬菜种质资源的保护和研究利用现状与展望[A];全国蔬菜遗传育种学术讨论会论文集[C];2002年
7 雷建军;陈国菊;曹必好;曾国平;;蔬菜基因工程研究进展[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
8 曹家树;王永勤;余小林;叶纨芝;向珣;卢刚;;白菜小孢子发育相关基因BCMF2的分离和表达特征分析[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
9 徐丽;张胜利;张建;陈颖;王兴智;朱筱娟;梁秀梅;;番茄抗黄瓜花叶病毒病基因转移的研究[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
10 梁东;马锋旺;夏惠;;果树基因工程研究进展[A];中国园艺学会第六届青年学术讨论会论文集[C];2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 王勇;细基格孢属、匍柄霉属及其近似属的形态学与分子系统学研究[D];山东农业大学;2010年
2 姜峰;拮抗酵母诱导番茄果实抗性基因的分离与功能鉴定[D];浙江大学;2008年
3 胡芳;甜柿果实采后生理变化对1-MCP处理的响应机制及电学特性变化的研究[D];西北农林科技大学;2010年
4 宋莉萍;不同时期叶施PGRs对大豆花荚的调控效应[D];黑龙江八一农垦大学;2011年
5 宋福南;白桦木质素合成苯丙氨酸途径相关酶基因的表达和功能分析[D];东北林业大学;2009年
6 许美容;非寄主抗性基因介导水稻抗细菌性条斑病的分子机理及水稻抗白叶枯病材料的筛选和QTL定位[D];中国农业科学院;2011年
7 韦小敏;斜卧青霉胞外蛋白质组学分析与纤维素酶合成调控机制研究[D];山东大学;2011年
8 张正科;1-MCP与内源乙烯相互作用对番茄和鳄梨成熟生理的影响研究[D];西北农林科技大学;2011年
9 张蕾;灰葡萄孢菌菌株CanBc-1生物学特性及其致病力衰退机制研究[D];华中农业大学;2010年
10 傅晶;抑制病原菌诱导的生长素的积累赋予水稻广谱抗性[D];华中农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 陈小红;藜蒿硅窗气调保鲜研究[D];华中农业大学;2010年
2 杨丹;湖北省油菜菌核病病菌多样性研究[D];华中农业大学;2010年
3 刘冉冉;枫香遗传转化体系的优化及转化PaFT基因的研究[D];华中农业大学;2010年
4 姚利玄;腌制萝卜工艺及黄变与脆度的关系研究[D];华中农业大学;2010年
5 张晓黎;番茄耐贮藏基因标记开发及辅助自交系选育[D];华中农业大学;2010年
6 任勇攀;外源RNA导入普通小麦中国春后的变异分析[D];山东农业大学;2009年
7 刘媛媛;番茄农杆菌介导基因转化技术体系的优化与番茄LeJA2基因的功能研究[D];山东农业大学;2009年
8 张立付;安徽省大豆疫病菌的分离、鉴定及致病型研究[D];安徽农业大学;2010年
9 赵鑫;特异性启动子调控ACC氧化酶反义基因载体构建及对甜瓜‘玉金香’的转化[D];甘肃农业大学;2010年
10 孙新荣;半夏主要病害及其对寄主保护酶活性影响[D];甘肃农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前2条
1 黄世钰,朱晓鲁,杨建;雪松疫霉根腐病药剂防治试验初报[J];江苏林业科技;1993年03期
2 陈宏宇;文景芝;;大豆疫霉菌遗传多样性的RAPD分析[J];中国油料作物学报;2006年03期
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
1 魏良民;韩亮;党新华;;新疆阿勒泰地区向日葵疫霉病发生调查分析[J];农业科技通讯;2014年05期
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 徐大雅;黄河;王春平;;疫毒蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳[J];真菌学报;1982年01期
2 余永年;李金亮;杨雄飞;;中国橡胶树疫霉种的研究[J];真菌学报;1986年04期
3 郑小波;陆家云;;福建、浙江、江苏、上海疫霉种的研究[J];真菌学报;1989年03期
4 张开春,吴禄平,李荣旗,毕晓颖,景士西,尹淑萍;RAPD技术——检测平邑甜茶遗传一致性的有效方法(简报)[J];农业生物技术学报;1997年02期
5 郑远旗,杨宗剑,李建吾,周立,吴文莲,余露;小麦内切多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的分离纯化研究[J];生物化学与生物物理学报;1994年05期
6 鞠戎,田颖川,沈全光,刘存德,莽克强;番茄多聚半乳糖醛酸酶cDNA的克隆及其对番茄中PG表达的反义抑制[J];生物工程学报;1994年02期
7 吕均良,陈昆松,张上隆,陈青俊;采后钙处理对猕猴桃软化、内源ABA和乙烯的影响[J];应用基础与工程科学学报;1996年04期
8 马辉刚;;云南辣椒疫病菌种的鉴定[J];云南农业大学学报;1988年02期
9 肖永清;橡胶树季风性落叶病区的条溃疡病防治问题[J];云南热作科技;1985年01期
10 杨雄飞,刘素清;芋疫霉在巴西橡胶树上的接种试验[J];云南热作科技;1985年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陆家云,龚龙英,何汉兴;疫霉属(Phytophthora)真菌生物学及分类研究[J];南京农业大学学报;1984年01期
2 周新根,朱宗源,江树俊;一种诱导樟疫霉形成大量孢子囊的方法[J];上海农业学报;1994年01期
3 朱杰华,张志铭,杨志辉;马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)A2交配型的研究进展[J];河北农业大学学报;1999年04期
4 李汝刚,伍宁丰,范云六,宋伯符;马铃薯抗晚疫病研究进展[J];中国马铃薯;1997年04期
5 张志铭,曹晨光,王慧生,姜兴亚,李玉琴,姜波,何清云,杨暖;呼伦贝尔市马铃薯晚疫病菌(Phytophthorainfestans)对甲霜灵抗药性的研究[J];中国马铃薯;2004年05期
6 陆家云,龚龙英;南京地区黄瓜疫病菌的鉴定及生物学特性的研究[J];南京农业大学学报;1982年03期
7 李淑娥,王志田,汤钿,马俊义,龚龙英;哈密瓜疫霉病菌生物学特性的研究[J];新疆农业科学;1984年05期
8 任华中,沈火林;辣椒抗疫病遗传与育种研究进展(综述)[J];中国农业大学学报;1996年03期
9 刘学敏,周艳玲,李立军,潘争艳;接种体密度、土壤水分基质势和土壤温度对辣椒疫病死苗率的影响(英文)[J];植物病理学报;2004年03期
10 ;土壤熏蒸防治非洲菊隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)[J];云南热作科技;2000年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 毕朝位;马金成;车兴壁;王中康;;致病疫霉(Phytophthora infestans)对甲霜灵抗性测定[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
2 ;Effects of Medium Nutrient on the Attachment Mode of Antheridia on Oogonia in Phytophthora sojae[A];第三届全国生物入侵大会论文摘要集——“全球变化与生物入侵”[C];2010年
3 张正光;王源超;郑小波;;大豆疫霉和苜蓿疫霉rDNA ITS序列比较研究[A];2003’华东植物病理学术研讨会暨江苏省植物病理学会第十次会员代表大会论文集[C];2003年
4 ;Cloning and Characterization of Three Hypersensitive-induced Reaction Genes From Glycine Max in Response to Phytophthora sojae Infecton[A];第十二届全国植物基因组学大会论文集[C];2011年
5 ;Molecular Identification of Phytophthora Species from Forests in South-west China[A];中国植物病理学会2010年学术年会论文集[C];2010年
6 ;Genetic analysis and SSR mapping of gene resistance to Phytophthora sojae race 1 in soybean cultivar "Suinong 10"[A];第十一届全国植物基因组学大会摘要集[C];2010年
7 梁元存;刘爱新;王玉军;董汉松;张天宇;;寄生疫霉ParA1基因的克隆及在大肠杆菌中的表达[A];中国烟草学会2004年学术年会论文集[C];2004年
8 左豫虎;薛春生;刘惕若;;大豆疫霉菌对大豆幼苗的侵染特性研究[A];中国植物病理学会第七届代表大会暨学术研讨会论文摘要集[C];2002年
9 王家和;唐嘉义;何永宏;刘云龙;;大围山自然保护区土壤真菌名录初报[A];中国植病学会西南联合学术年会论文集[C];2000年
10 郭军;屈冬玉;王晓武;金黎平;谢开云;Rays Jiang;Francine Govers;;利用cDNA-AFLP技术鉴定马铃薯晚疫病菌小种特异无毒基因候选表达序列[A];蔬菜分子育种研讨会论文集[C];2004年
中国重要报纸全文数据库 前8条
1 方海 编译;美学者发现棕榈科植物易染病[N];中国花卉报;2004年
2 周明华 杜国兴;利用风险预警与快速反应机制更好地发挥把关服务功能[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2002年
3 廖太林 袁克 吴翠萍 李百胜 沈毅诚 安榆林;栎树的毁灭性病害[N];中国国门时报(中国出入境检验疫报);2002年
4 施鼎康  ;雪松疫霉腐烂病[N];中国花卉报;2004年
5 章桂明;深圳首次从进口大豆中检出疫霉病菌[N];国际商报;2003年
6 方海 编译;橡树猝死病肆虐欧美[N];中国花卉报;2003年
7 ;美国找到遏制橡树猝死病方法[N];中国花卉报;2003年
8 方海 编译;美国橡树猝死病有药可防[N];中国花卉报;2004年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 朱杰华;中国马铃薯晚疫病菌群体遗传结构研究[D];河北农业大学;2004年
2 巩振辉;疫病(Phytophthora cinnamomi)pg基因的克隆、测序及其遗传转化研究[D];西北农林科技大学;2003年
3 蒋冬花;隐地疫霉(Phytophthora cryptogea) Cryptogein基因的克隆及其功能的研究[D];浙江大学;2002年
4 冯宝珍;辣椒疫霉(Phytophthora capsici)诱导坏死蛋白基因克隆及功能研究[D];山东农业大学;2011年
5 付丽;辣椒疫霉(Phytophthora capsici)果胶裂解酶基因克隆及功能研究[D];山东农业大学;2012年
6 刘廷利;大豆疫霉CRN基因家族效应分子的功能研究[D];南京农业大学;2010年
7 李艳青;辣椒疫霉(Phytophthora capsici)多聚半乳糖醛酸酶功能研究及N-糖基化对其致病性影响[D];山东农业大学;2011年
8 王永林;大豆疫霉转录因子PsCZF1、PsHSF1和PsMAD1的功能研究[D];南京农业大学;2009年
9 张美祥;寄生疫霉菌结构独特的质膜氢离子通道蛋白基因PnPMA1功能的初步研究[D];西北农林科技大学;2012年
10 李爱宁;大豆疫霉促有丝分裂原蛋白激酶PsSAK1和PsMPK1的功能分析[D];南京农业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 彭学文;河北省马铃薯病害调查及主要真菌病害研究[D];河北农业大学;2003年
2 邓宇;转不同阳离子抗菌肽基因的烟草对黑胫病菌(Phytophthora nicatianae)的抗病性比较[D];西南农业大学;2003年
3 武琼;辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)阿魏酸酯酶基因克隆及其致病功能分析[D];山东农业大学;2012年
4 邵铁梅;致病疫霉(Phytophthora infestans)的寄主特异性研究[D];河北农业大学;2002年
5 周向平;烟草黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)的拮抗内生细菌筛选、鉴定与应用研究[D];湖南农业大学;2004年
6 孙冰冰;辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)肉碱酰基转移酶基因克隆及功能研究[D];山东农业大学;2012年
7 陈宏宇;大豆疫霉根腐病菌(Phytophthora sojae)同工酶及RAPD标记研究[D];东北农业大学;2001年
8 毕朝位;重庆地区致病疫霉[Phytophthora infestans(Mont.)de Bary]生物学特性研究[D];西南农业大学;2002年
9 马丽艳;南瓜疫病菌(Phytophthora capsici Leon.)毒素致病机理及抗源筛选研究[D];东北农业大学;2003年
10 赵建;缬氨酰胺衍生物的合成及其生物活性研究[D];中国农业科学院;2012年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026