中国葡萄属野生种抗白粉病基因cDNA克隆及序列分析

【摘要】： 中国葡萄属野生种对真菌病害具有丰富多样的抗性。如何有效地利用这些种质中的抗病基因，改良现有的欧洲葡萄栽培品种，实现抗病与品质结合，是葡萄育种家长期攻克的目标，也是我们从事的重要攻关课题。 本研究在田间葡萄白粉病发病盛期，对中国葡萄属野生种华东葡萄株系白河-35-1、感病的欧洲葡萄品种佳利酿及其F_1代感病单株6-12-3，用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌，诱导抗病性表达。在不同时期分别提取叶片总RNA，利用mRNA差异显示技术，经DDRT-PCR、测序胶电泳、银染、Northern杂交、序列测定及Blast检索。获得了与葡萄抗白粉病基因相关的差异表达cDNA片段及其序列，并对序列进行了同源性比较分析。取得的主要的研究结果是： 1．建立了适于葡萄材料总RNA提取的改进SDS／酚法。在改进SDS／酚法中，向提取缓冲液加入16％水溶性PVP和1％β-巯基乙醇，有效抑制了酚类物质的影响；在匀浆上清液中加入1／3体积5mol·L~(-1)乙酸钾(pH4.8)，可以去除多糖的干扰。因此，改进的SDS／酚法能有效抑制酚类物质和多糖对总RNA提取的影响，获得质量高、完整性好的总RNA，28S rRNA亮度约为18S rRNA的2倍，A260／280介于1.8～2.0之间，A260／A230大于2.0，幼叶总RNA产率为261.20μg／g，成熟叶产率为191.40μg／g，完熟果皮产率为31.50μg／g。 2．建立了葡萄抗白粉病基因DDRT-PCR体系。筛选了DDRT-PCR体系中各反应因素的浓度，优化后25μL体系中各组份浓度为：cDNA第一链产物1.0μL(RT反应体系中总RNA用量1.5μg)、dNTPs浓度为0.25mmol／L、MgCl_2浓度为1.5mmol／L、锚定引物浓度为2.5mmol／L、随机引物浓度为2.5mmol／L、Taq酶用量为1.0U。该反应体系的产物经测序胶电泳和银染，可以获得数量适宜、带型清晰、重复性好的cDNA片段。 3．应用mRNA差异显示技术研究中国葡萄属野生种华东葡萄株系白河-35-1在白粉病病原菌侵染诱导下，抗白粉病基因的表达。获得了抗白粉病基因差异表达的cDNA片段19个，经二次PCR扩增和Northern杂交分析，最终获得了抗白粉病基因的5个cDNA片段：T11CA／B0322-280(Vprdrf4)、T11GC／S11-428(Vprdrf7)、T11CA／B0313-410(Vptual)、T11CA／B0315-360(Vprdrf3)、T11CA／B0304-474(Vprdrf2)，分别由280bp、428bp、410bp、360bp和474bp的碱基序列组成。GenBank 中的登录号依次为:CD347664，CD347666，CD662166，CD347663，CD347662。 4.研究了感病的欧洲葡萄品种佳利酿和白河一35一IX佳利酿的Fl代感病单株 6一12一3在白粉菌侵染条件下，基因差异表达的情况，获得了感病相关cDNA片段6 个:TI IGC/B0316一220、TllGC/B 0316一450、TllCA/BO314一960、TllGC/B 0316一440、 TI IC刀BO304一420、TI IC户JB0320一210;感病亲本佳利酿中特异表达的eDNA片段5 个:TllGC/B 0316一410、TllGC/B 0316一250、TllC户JB0304一420、TllCA/B0340一720、 TllCA/B0316一1000;感病后代6一12一3中特异表达的eDNA片段12个: T 1 1 CA/B0304一550、TllGC/B 0316一265、TllGC旧0316一430、TllC户JB0320一390、 T 1 1 CA/B0304一390、TllCA/B0313一290、TllCA了B0313一340、TllCA/BO313一380、 TI ICA/BO313一450、TllCA/B 0313一650、TllCA/B0313.780、TllCA/B0304一470。 5.测序结果在基因数据库及蛋白质数据库中的同源性对比分析表明，vPtual为 编码葡萄叶片a一微管蛋白基因的部分序列，长度为410 bp。分析了VPtual在葡萄抗 白粉病过程中表达调控的变化。该基因的表达水平随侵染时间延续逐渐减小并消失， 为负调控基因片段。Vprd麟为编码葡萄叶片核糖体RNA基因的部分序列，长度为 280饰。VPrdrf4在葡萄抗白粉病过程中，表达水平随侵染时间延续逐渐增高，为正 调控基因片段。