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中国葡萄属野生种抗白粉病基因cDNA克隆及序列分析

张今今  
【摘要】: 中国葡萄属野生种对真菌病害具有丰富多样的抗性。如何有效地利用这些种质中的抗病基因,改良现有的欧洲葡萄栽培品种,实现抗病与品质结合,是葡萄育种家长期攻克的目标,也是我们从事的重要攻关课题。 本研究在田间葡萄白粉病发病盛期,对中国葡萄属野生种华东葡萄株系白河-35-1、感病的欧洲葡萄品种佳利酿及其F_1代感病单株6-12-3,用病叶压片法人工接种葡萄白粉病病原菌,诱导抗病性表达。在不同时期分别提取叶片总RNA,利用mRNA差异显示技术,经DDRT-PCR、测序胶电泳、银染、Northern杂交、序列测定及Blast检索。获得了与葡萄抗白粉病基因相关的差异表达cDNA片段及其序列,并对序列进行了同源性比较分析。取得的主要的研究结果是: 1.建立了适于葡萄材料总RNA提取的改进SDS/酚法。在改进SDS/酚法中,向提取缓冲液加入16%水溶性PVP和1%β-巯基乙醇,有效抑制了酚类物质的影响;在匀浆上清液中加入1/3体积5mol·L~(-1)乙酸钾(pH4.8),可以去除多糖的干扰。因此,改进的SDS/酚法能有效抑制酚类物质和多糖对总RNA提取的影响,获得质量高、完整性好的总RNA,28S rRNA亮度约为18S rRNA的2倍,A260/280介于1.8~2.0之间,A260/A230大于2.0,幼叶总RNA产率为261.20μg/g,成熟叶产率为191.40μg/g,完熟果皮产率为31.50μg/g。 2.建立了葡萄抗白粉病基因DDRT-PCR体系。筛选了DDRT-PCR体系中各反应因素的浓度,优化后25μL体系中各组份浓度为:cDNA第一链产物1.0μL(RT反应体系中总RNA用量1.5μg)、dNTPs浓度为0.25mmol/L、MgCl_2浓度为1.5mmol/L、锚定引物浓度为2.5mmol/L、随机引物浓度为2.5mmol/L、Taq酶用量为1.0U。该反应体系的产物经测序胶电泳和银染,可以获得数量适宜、带型清晰、重复性好的cDNA片段。 3.应用mRNA差异显示技术研究中国葡萄属野生种华东葡萄株系白河-35-1在白粉病病原菌侵染诱导下,抗白粉病基因的表达。获得了抗白粉病基因差异表达的cDNA片段19个,经二次PCR扩增和Northern杂交分析,最终获得了抗白粉病基因的5个cDNA片段:T11CA/B0322-280(Vprdrf4)、T11GC/S11-428(Vprdrf7)、T11CA/B0313-410(Vptual)、T11CA/B0315-360(Vprdrf3)、T11CA/B0304-474(Vprdrf2),分别由280bp、428bp、410bp、360bp和474bp的碱基序列组成。GenBank 中的登录号依次为:CD347664,CD347666,CD662166,CD347663,CD347662。 4.研究了感病的欧洲葡萄品种佳利酿和白河一35一IX佳利酿的Fl代感病单株 6一12一3在白粉菌侵染条件下,基因差异表达的情况,获得了感病相关cDNA片段6 个:TI IGC/B0316一220、TllGC/B 0316一450、TllCA/BO314一960、TllGC/B 0316一440、 TI IC刀BO304一420、TI IC户JB0320一210;感病亲本佳利酿中特异表达的eDNA片段5 个:TllGC/B 0316一410、TllGC/B 0316一250、TllC户JB0304一420、TllCA/B0340一720、 TllCA/B0316一1000;感病后代6一12一3中特异表达的eDNA片段12个: T 1 1 CA/B0304一550、TllGC/B 0316一265、TllGC旧0316一430、TllC户JB0320一390、 T 1 1 CA/B0304一390、TllCA/B0313一290、TllCA了B0313一340、TllCA/BO313一380、 TI ICA/BO313一450、TllCA/B 0313一650、TllCA/B0313.780、TllCA/B0304一470。 5.测序结果在基因数据库及蛋白质数据库中的同源性对比分析表明,vPtual为 编码葡萄叶片a一微管蛋白基因的部分序列,长度为410 bp。分析了VPtual在葡萄抗 白粉病过程中表达调控的变化。该基因的表达水平随侵染时间延续逐渐减小并消失, 为负调控基因片段。Vprd麟为编码葡萄叶片核糖体RNA基因的部分序列,长度为 280饰。VPrdrf4在葡萄抗白粉病过程中,表达水平随侵染时间延续逐渐增高,为正 调控基因片段。


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