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《西北农林科技大学》 2003年
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大蒜(Allium sativum L.)体细胞无性系变异规律和筛选利用研究

张恩让  
【摘要】: 大蒜是重要的蔬菜作物之一。因长期无性繁殖,品种老化和退化严重,但有性世代退化而缺乏有效的育种途径。在组织培养过程中,一般体细胞无性系变异(SV)率很高。研究和利用体细胞无性系变异,对以大蒜为代表的无性繁殖作物的品种改良具有特殊的价值和意义。 本研究以大蒜为材料,研究了芽直接再生途径和愈伤组织途径再生植株的过程中SV的发生规律;并进行了耐盐和抗除草剂变异体筛选,获得了以下主要结果: 大蒜SV主要发生在愈伤组织形成阶段和愈伤组织继代增殖过程中。供试的5个品种茎尖生长点直接生芽培养时,由于没有经历愈伤组织阶段,所以,在再生植株中,几乎没有检测到染色体变异发生;而经历愈伤组织诱导培养,再分化形成的再生植株均出现了高频率的SV,且染色体变异频率随着培养时间的延长而增加,说明变异是在愈伤组织培养过程中依次出现并累加的。 在原产于中国的4个不同生态类型的大蒜品种和从英国引入中国杨凌并试种了1年的欧洲品种上,经组织培养产生的愈伤组织和体细胞无性系均发生了不同程度的细胞染色体变异,5个品种(改良蒜、金堂早蒜、彭县晚熟、苍山蒜和欧引01)愈伤组织二倍体细胞比率分别为66.7%、60.0%、56.7%、53.3%和63.3%,说明了SV是大蒜各品种广泛存在的现象。以2个品种3个不同的器官(蒜基、蒜瓣和叶片)为外植体经愈伤组织途径组织培养,SV现象同样发生。 在大蒜SV的研究过程中我们发现,SV的发生是不均一的。不同的品种,SV发生的频率不同;同一品种不同类型的外植体诱导的愈伤组织中,SV的发生频率也不同。利用改良蒜的蒜基、蒜瓣和叶片做外植体诱导出来的愈伤组织中,二倍体细胞比率分别为66.7%、46.7%和43.3%;苍山蒜有相似的变异趋势。变异的方向也不同,染色体数目有四倍体等整倍体变异,也有亚倍体和超倍体变异;染色体结构有断片、粘连、交叉、缠绕和染色体桥等变异。 SV的表现形式既有表型上的变异,也有内部细胞水平和分子水平上的变异。表型上变异的范围包括:叶色变深(或浅),叶片变厚(或薄),叶型变宽,假茎变粗(或细)及长(或短),鳞茎有无、变大(或小),根系的多少、长短,植株的生长情况以及嵌合体变异等。内部的变异包括染色体倍性的变异、染色体结构的变异、同工酶的变异和醇溶蛋白的变异。SV呈现多样化的趋势。 SV发生受培养条件和培养环境的影响。愈伤组织诱导时,培养基中不同激素比 例和浓度高低使愈伤组织细胞中二倍体率在43.3%一63.3%之间变动:在MS培养基中 增殖的愈伤组织细胞二倍体率(36.7%)比相同条件下在LS培养基和BS培养基中增殖 的愈伤组织细胞二倍体率(30.0%和16.7%)高;愈伤组织继代时,随着继代次数的 增加,愈伤组织中二倍体细胞比率下降,继代3次和继代12次相比,愈伤组织中二 倍体细胞比率由开始的53.3%下降到3.3%。随着培养温度的升高,二倍体细胞比率 下降;愈伤组织培养条件和培养环境对愈伤组织的再分化也产生了较大的影响。 在愈伤组织阶段,染色体倍性和结构已发生了很大的变异;在形成幼苗后,幼苗 的同工酶和醇溶性蛋白即表现出变异,这些都是SV的早期表现。 根据适应性选择的原理,本研究建立了两个大蒜愈伤组织耐盐变异系的逐步筛选 体系。从含0.1%NaCI的培养基开始,一个体系每步培养4周,另一个每步培养8周, 培养到规定时间后,再筛选发育良好的愈伤组织分别转入到下一级培养基培养,培养 基中的NaCI浓度由低到高梯次上升,对愈伤组织进行逐步筛选,获得了5个大蒜品 种(改良蒜、金堂早蒜、彭县晚熟、苍山蒜和欧引01)耐盐细胞变异系,稳定性检 验证明,这种耐盐性在一定时间内能够保持。对两个筛选体系的比较发现,每步培养 8周的选择效果较好。 根据突变性选择原理,将常规愈伤组织直接转接入含盐培养基中选择耐盐突变 体,在NaCI浓度小于(等于)1 .0%的培养基上,筛选出了两个大蒜品种(改良蒜和 苍山蒜)耐盐突变细胞系。 将获得的耐盐细胞系转入无盐培养基中分化芽和根,在不加任何激素的MS培养 基上,细胞系都分化出了芽。逐步筛选出的5个品种(改良蒜、金堂早蒜、彭县晚熟、 苍山蒜和欧引01)耐盐细胞系芽分化数分别为2.5、2.2、2.2、2.4和2.3个。一步筛 选选出的两个耐盐细胞系(改良蒜和苍山蒜)芽分化数分别为2.0和2.4个;将分化 出芽的细胞系转入培养基MS+N AAO.Zm叭中诱导生根,上述7个细胞系的生根数分 别为7.8、6.6、6.4、7.0、7.0、6.0和5.6条。 一步筛选获得的耐盐细胞系,初期选择效率低,愈伤组织在高盐(l .0%)胁迫下, 只有改良蒜、金堂早蒜和苍山蒜少数成活,成活率不到10%。但由此获得的改良蒜和 苍山蒜的无性系经耐盐稳定性鉴定,它在高盐(l .0%)环境中也能正常生长,存活率 达到50%和60%。由在高盐(l .0%)环境中存活的无性系做外植体诱导出来的愈伤 组织,转入高盐(l .0%)培养基中,存活率达到87%以上。 用改良蒜、金堂早蒜、苍山蒜和欧引01等4个大蒜品种,在含有0.02%,0.04%, 0.06%,0.08%,0.10%,0.20%的草甘磷培养基上逐步培养,进行筛选。即建立了两 个大蒜愈伤
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