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《西北农林科技大学》 2003年
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Aroclor 1254对3种成纤维细胞的毒性及绵羊ES细胞的分离

杨奇  
【摘要】: 本论文利用建立的新生犊牛睾丸、肾脏和小鼠胎儿成纤维细胞模型,系统研究了Aroclor 1254对过氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、超微结构变化等的毒性。同时,比较了饲养层细胞类型、生长因子、胚胎发育阶段等因素对绵羊胚胎干细胞分离培养效果的影响。主要结果如下: 1.通过对机械法、酶学法、螯合剂法等三种离散方法的恰当联合应用,分别建立了小鼠胎儿和新生犊牛睾丸、肾脏等三种成纤维细胞的有效分离培养体系。睾丸成纤维细胞分离培养,本实验是在小鼠成纤维细胞分离培养方法的基础上,从消化时间、消化液浓度等方面作了适当调整,获得良好的效果;肾脏成纤维细胞的分离培养最初是参照黄冰等的方法,本实验加上消化这一环节后获得了良好效果,主要表现在贴壁细胞数量增多,贴壁所需时间长缩短。 2.来源于不同的动物、组织的三种成纤维细胞在形态和生长行为上均存在差异:小鼠胎儿成纤维细胞贴壁最快,一般在接种后30min就有大量细胞贴壁,第2、3天达到生长高峰期,4、5天以后进入平台期,细胞连接成片,象平静的湖面。新生犊牛睾丸成纤维细胞贴壁较慢,一般在接种后24h才能有足量细胞贴壁,在第3、4天达到生长高峰期,5、6天以后进入平台期,细胞排列不规整,细胞层表面也不平整,象起着涟漪的水面。新生公牛犊肾脏成纤维细胞贴壁时间最晚,接种后第三天换液时,只有少量细胞贴壁,大量细胞仍悬浮于培养液中,可通过换液清除,在第7、8天达到生长高峰期,细胞纤维状形态明显、排列不规整,细胞层表面象大片旋涡连接成的水面。 3.自制的胚胎冷冻液含有三种不同的冷冻保护剂(包括渗透性和非渗透性保护剂),冷冻胚胎解冻后可用率在95%左右,比常用的DMSO冷冻液更适宜于这三种细胞的冷冻保存。 4.三种成纤维细胞的抗氧化损伤能力不同,培养液中SOD活性依次为小鼠胎儿>新生犊牛肾脏>新生犊牛睾丸。 5.多氯联苯可以通过氧化损伤的途径对三种成纤维细胞发挥毒性作用。 6.多氯联苯首先是促进细胞氧自由基的生成而对细胞造成氧化损伤,细胞为了清除过多的氧自由基而增强了SOD的合成。随着毒物作用时间的延长,清除大量自由基使得SOD因消耗过多而活性下降,同时由于氧化损伤使得细胞合成SOD的能力降低,导致细胞的氧化损伤进一步加剧。 7.暴露于Aroclor 1254的小鼠胎儿和新生公牛犊肾脏、睾丸成纤维细胞的超微结构的观察结果表明,三种细胞的生物膜结构均受到不同程度的损伤,严重者以细胞质内空泡化为其典型特征;三种细胞对Aroclor 1254毒性作用的受损程度以小鼠胎儿成纤维细胞最严重,其次是新生牛犊的睾丸成纤维细胞,新生犊牛肾脏成纤维细胞 Aroclor1254对3种成纤维细胞的毒性及绵羊Es细胞的分离 最轻。 8.暴露于Aroclor 1254的三种不同来源的成纤维细胞中都观察到一定的变化, 有的细胞核内具有较粗大的核仁,核仁区的组织结构特征明显,这意味着细胞内的基 因转录的活跃状态,表明Aroclor 1254可能影响了细胞内的基因转录体系的状态。 9.发现泡状结构的非均一性及其形成方式的差异表明:Aroclor 1254促使细胞 内生成大量氧自由基,通过脂质过氧化途径对生物膜造成直接损伤;同时,Aroclor 1254诱导产生的氧自由基还可能通过其他氧化损伤途径,致使细胞代谢体系的酶失 活,引起细胞内生物膜的功能无法正常发挥,导致生物膜结构的改变。 10.观察到细胞质内出现的膜包被的泡状结构具有非均质性,如有的泡膜结构清 晰,内有均质的无定形物质;有的呈空泡样,内中无物,空泡被膜界限模糊不清,其 周围电子密度较高;有的小泡内可见到少许絮状物。这些泡状结构的形成与线粒体和 内质网的损伤有关,其形成方式主要有以下几种:①线粒体膨大,内靖消失;②内质 网断裂碎片的双层膜与其内容物共同形成边界膜结构清晰、内有均质的无定形物质泡 状结构;③内质网碎片或线粒体形成泡状结构与周围结构分离;④内质网双层膜之间 裂解,形成较大的规则或不规则泡状结构。以③、④方式形成的泡状结构为无膜包被 结构。 n.在绵羊胚胎干细胞的分离过程中,选用囊胚的效果优于桑堪胚。桑堪胚培养 要经历囊胚、孵化胚阶段,与囊胚相比,孵化、贴壁时间要延长12~36h。从胚胎贴 壁率、ICM的增殖和随后ES细胞分离效果上囊胚略优于桑堪胚。 12.小鼠胎儿成纤维细胞饲养层在胚胎贴壁时间、胚胎贴壁率、工CM的增殖、ES 细胞的分离效果上均优于新生犊牛皋丸和肾脏成纤维细胞饲养层,更适宜于绵羊胚胎 干细胞的分离。 13.添加LIF、IGF一1和SCF等生长因子对胚胎的贴壁率都有不同的程度的提高, 而且三种生长因子的组合搭配对ICM的增殖和ES细胞的分离均有所帮助。含有工GF一1 的试验组主要表现在工CM和滋养层细胞的增殖速度明显加快、胚胎孵化贴壁时间提 前、贴壁后处于增殖高峰期的ICM相对较大。含有LIF的试验组主要表现在胚胎贴壁 率相对较高,传代时的ICM及随后的ES集落在体积和形态上优于对照组。添加SCF 的试验组主要表现在ICM的增殖速度及传代后ES集落出现的时间和增殖速度比较快。
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