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《西北农林科技大学》 2003年
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人乳铁蛋白cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达

陈建明  
【摘要】: 乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)是由哺乳动物乳腺和其他外分泌腺产生的一种铁结合糖蛋白,广泛存在于乳汁、唾液、眼泪等分泌物中,因其具有抗病毒、杀菌、免疫调节、基因转录活化等多种生物学活性而受到普遍关注和广泛重视,自被发现以来就一直是世界各国学者研究的热点。 毕赤酵母是近年来发展起来的一种新型酵母表达系统,它兼有原核细胞的生长特性和分子遗传背景,又有真核生物的特性,可以对外源蛋白质进行蛋白质糖基化、二硫键形成等翻译后修饰,在过去的20年中已经有超过200种不同的蛋白质在毕赤酵母中实现了成功表达。 本实验以采自北京友谊医院孕妇全血作为材料,提取嗜中性粒细胞,运用RT-PCR方法扩增了人乳铁蛋白的cDNA,将其克隆到pGEM-T easy载体上并进行序列测定与分析。结果表明,所克隆的hLF cDNA序列全长为2136bp,我们将本实验所得人乳铁蛋白序列与GenBank中登录的其它8个hLF cDNA序列进行同源性比较,同源性均在99%以上。 本实验中以pGEM-T easy/hLF为模板,根据pPIC9K设计特定的引物,用高保真酶Pfu扩增hLF基因,将其克隆到pPIC9K中,经酶切鉴定和序列测定确认hLF基因插入多克隆位点并且开放性读码框正确后,SalⅠ线性化重组质粒pPIC9K/hLF,用电击的方法转入毕赤酵母GS115中。30℃培养数天后从MD平板上挑取His~+克隆,对比在MM和MD平板上的生长情况确定转化子的表现型。Lyticase酶裂解酵母细胞,以裂解后暴露的酵母基因组为模板,采用PCR方法确认有hLF基因整合到酵母基因组中。将鉴定有hLF基因整合酵母转化子接种到BMGY/BMMY培养基中发酵培养,用1%和2%的甲醇诱导,收集诱导不同时间的上清,用三氯醋酸(trichloroacetic acid,TCA)沉淀蛋白,用SDS-PAGE、ELISA、Western blot和Dot blot等方法检测目的蛋白的表达。结果表明,1%甲醇诱导48h后表达量最高,ELISA、Western blot和Dot blot等方法检测均说明人乳铁蛋白基因在毕赤酵母系统中得到了表达。 总之,本实验克隆了人乳铁蛋白基因,并且构建了酵母表达质粒,探索了毕赤酵母生长、转化、筛选、诱导表达及蛋白检测等一系列条件,初步构建了一套酵母表达系统,并且分泌性表达了人乳铁蛋白,为以后规模化发酵生产奠定了基础。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:Q786

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【参考文献】
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 徐荣燕;嗜热真菌糖苷酶的基因克隆、表达与分子改造[D];山东农业大学;2010年
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5 李振东;东祁连山高寒草地优势植物内生细菌多样性研究[D];甘肃农业大学;2010年
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【同被引文献】
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1 张丹凤,陆东林;乳铁蛋白及其生理功能[J];草食家畜;2002年02期
2 郑青,黄自然,姚汝华,苏智慧,郑学勤,王宇光;人工合成Cecropin AD基因在酵母中表达[J];蚕业科学;1999年03期
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【二级引证文献】
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【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前7条
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7 万榕;蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂(sv-cystatin)抗黑色素瘤细胞侵袭与转移的作用[D];福建医科大学;2005年
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10 陈伟莉;重组人TRAIL的制备和抗肿瘤作用的研究[D];吉林大学;2007年
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1 陈建明;人乳铁蛋白cDNA的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];西北农林科技大学;2003年
2 高华颖;人乳铁蛋白(HLF)基因cDNA的细胞表达及精子介导转基因动物制备的研究[D];辽宁师范大学;2003年
3 耿士忠;酪蛋白调控序列指导下的人乳铁蛋白基因在动物乳腺中表达特性的研究[D];扬州大学;2002年
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5 牛超;重组人弹力素大规模发酵工艺的优化[D];吉林大学;2010年
6 翟立公;Spinigerin a抗菌肽基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];吉林农业大学;2011年
7 李洋;重组人FGF-2的制备及活性研究[D];吉林大学;2010年
8 陈丽;多拷贝毕赤酵母重组菌表达PIP生理特性和动力学研究[D];华东理工大学;2011年
9 王少然;二硫键对菌丝霉素抗菌活性的影响及菌丝霉素聚体在毕赤酵母中的表达[D];中国农业科学院;2011年
10 朱维宁;小麦类脱水素基因wzy2的克隆及在毕赤酵母中的功能分析[D];西北农林科技大学;2010年
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