农杆菌介导的甘蓝遗传转化体系的研究

【摘要】： 本研究以三个甘蓝品种为试材，在两个农杆菌菌株LBA4404(携带nptⅡ基因和gus基因)和GV3101(携带Bari-1基因和hpt基因)的介导下，重点研究了植株原位真空渗入遗传转化体系，包括适宜苗态建成方法研究、转化影响因素研究、转化体筛选及鉴定三部分。另外，初步对甘蓝高频芽再生技术进行了研究。实验结论如下： 1．鸡心、黄苗甘蓝品种于8月5日、8月10日露地播种，鸡心甘蓝品种叶数超过30片，株高23.03cm，茎粗达1.758cm；黄苗品种叶数超过37片，株高18.40cm，茎粗达1.739cm，均易形成甘蓝植株原位真空渗入遗传转化的适宜苗态； 2．影响甘蓝植株原位真空渗入遗传转化诸因素的研究表明：(1)鸡心品种外源基因的转化频率明显高于黄苗品种；(2)菌株LBA4404介导的转化频率较GV3101高；(3)渗入培养基中添加乙酰丁香酮以及pH为6时，其转化率较对照有明显提高，而蔗糖浓度的高低对转化率没有明显影响；(4)黄苗品种的最佳真空渗入时间为8min／间歇2min／30s，鸡心为6min／间歇2min／30s，转化率不因增加真空渗入间歇次数而有明显的提高；(5)在蕾期对花蕾进行真空渗入比对根、茎、叶进行真空渗入转化率高。 3．建立了培养基筛选甘蓝转基因植株的卡那霉素最佳浓度和筛选最佳时期。鸡心品种卡那霉素筛选的最佳浓度为30mg／L，黄苗品种卡那霉素筛选的最佳浓度为40mg／L；筛选时间以20日龄开始。鉴别转化体的标准：在卡那霉素筛选培养基上，20日龄以上的甘蓝植株生长正常，叶片显绿，有侧根发出或真叶长出或既有侧根发出又有真叶出现。 4．建立了生长点点滴法筛选甘蓝转基因植株的潮霉素最佳浓度和筛选最佳时期。鸡心、黄苗品种潮霉素筛选的最佳浓度为800mg／L，筛选时间自接种潮霉素后10d开始。筛选转化体的标准：真叶长出，叶色显绿，生长正常。 5．本研究共得到卡那霉素抗性植株150株，潮霉素抗性植株55株。从潮霉素抗性植株中随机抽取7株进行PCR检测，均有目标条带扩增出来，说明外源基因已整合到植物基因组中。 6．以牛心品种为试材，研究了外植体类型、激素配比、AgNO_3、苗龄、预培养等对甘蓝离体培养不定芽诱导的影响。研究表明，6d苗龄的甘蓝下胚轴外植体在附加4.0mg/L 6-BA的MS培养基上培养，芽分化率最高，达64.28％，平均每个外植体产芽数2.28个；AgNO_3对下胚轴不定芽的分化有促进作用；预培养2d再转入分化培养基中芽再生率提高28.57％。