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转录因子DREB1C对植物耐盐性的影响

闫冬青  
【摘要】: EREBP/AP2类蛋白是一个仅存在于植物中的DNA结合蛋白(DBP)大家族。其中一些成员如AtERF,Pti,APETALA2及AtDREB/CBF分别在植物的乙烯应答,防御反应,生长发育及逆境胁迫反应中起重要的调控作用。 最近,利用酵母单杂交技术,从拟南芥中克隆了两个不同的基因——DREB1和DREB2。它们编码着与拟南芥rd29A基因的DRE顺式作用元件特异结合的转录因子,参与在干旱,高盐及低温胁迫条件下的rd29A基因的表达调控作用。DREB1蛋白和DREB2蛋白之间,在整体的氨基酸序列上没有同源性,但这两个转录因子都含有一个十分保守的EREBP/AP2结构域,属于EREBP/AP2类蛋白家族。DREB1有三个同源基因,分别叫做DREB1A,DREB1B和DREB1C。日本Yamaguchi-shinozaki and Shinozaki实验室对DREB1A进行了深入的研究。DREB1B与CBF1相同,Stockinger实验室对其进行了深入的研究,两实验室分别揭示了DREB1A和CBF1/DREB1B的抗逆性。DREB1C包含一个单独的216个氨基酸的开放读码框,推导其所编码的蛋白质分子量为24.3KD,但对其抗逆性的研究尚未有报道。 为了拓宽对参与植物胁迫应答的调控分子的认识,本论文从DREB1C的克隆着手,以拟南芥为材料,通过转基因的方法,首次研究了DREB1C这种EREBP/AP2类蛋白对植物耐盐性的的影响,研究结果如下: 1.我们从拟南芥基因组中克隆了DREB1C基因全长,并将其连接到中间载体pGEM-T-easy上,进行了测序验证,结果显示所克隆的DREB1C序列完全正确。 2.构建了DREB1C正义植物双元表达载体。选择带有GUS报告基因(1.87kb)的pBII21质粒为表达载体,其筛选标记为卡那霉素。载体全长为13kb,有一个烟草花叶病毒35S强启动子和Nos终止序列,利用BamHI和Sacl做为酶切位点,构建载体。载体构建完成后经酶切验证完全正确。 3.用抽真空法将构建好的植物双元表达载体(35S:DREB1C)通过农杆菌介导转入拟南芥中,获得18个独立的转基因株系,L1—L18。L1—L18分单株收取种子,获得T2代转基因植株。根据遗传学分离定律,挑选3:1分离的株系,分单株收取种子,获得T3代纯合体转基因植株,用于进一步的耐盐性分析。 4.提取转基因植株的基因组DNA,进行PCR反应,证明了DREB1C确实转入拟南芥中。 5.对转基因植株进行了Northern杂交分析,结果可以看出,转基因植株在非胁迫条件下,DREB1CmRNA的量明显高于野生型对照。说明转入的DREB1C 转录因子DREBIC对植物耐盐性的影响 在转录水平上有表达,没有发生基因沉默,此阳性转基因植株可用作对 刀五E召IC功能进行研究的材料。 6.验证了及心沼IC对植物耐盐性的影响。实验结果显示,刀尺石万IC基因的过量 表达能明显提高转基因拟南芥的耐盐性。在含100 mM NaCI的MS培养基上 胁迫十天后,野生型植株生长受抑制,较矮小;而转基因植株生长正常;在 含150 nlMNacl的MS培养基上胁迫十天后,野生型植株生长受严重抑制, 叶子卷曲,盐害症状明显,而转基因植株仍能较正常生长;在不含NaCI的 MS培养基上,转基因植株根系发达,尤其侧根数目明显多于对照。


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