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《西北农林科技大学》 2003年
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毒杀松墨天牛虫生真菌蛋白的研究

李建庆  
【摘要】: 松墨天牛是我国重要的林业害虫,除取食危害松树外,还传播松材线虫病,已对我国松树造成严重危害。虫生真菌是一类重要的生防真菌,在生产上应用广泛,防治松墨天牛在生产上也早有应用,但目前多利用其孢子粉剂或液剂,在应用中受到很大限制。本研究是从虫生真菌中寻找对松墨天牛有毒杀作用的蛋白,该研究可从生物化学和分子生物学的角度揭示虫生真菌的致病机理,同时为培育抗天牛苗木奠定基础。 实验选取6株代有表性的虫生真菌,用硫酸铵沉淀浓缩、透析的方法提取了6种胞外全蛋白提取液,用研磨菌丝法提取了6种菌丝体内全蛋白提取液,再通过制备电泳和洗脱凝胶的方法从这12种全蛋白提取液中分离纯化出了48种单一蛋白,其中菌丝体内蛋白26种,胞外蛋白27种。 通过对48种单一蛋白的初筛生测,筛选出19种弱毒性蛋白和4种高毒性蛋白,有25种蛋白不表现毒性。弱毒性蛋白又可分为低弱毒性蛋白和高弱毒性蛋白,低弱毒性蛋白10种,分别为Bb36W-E、Bb36N-B、Bb36N-D、Bb36N-E、Bb03W-A、Bb03N-C、Bb03N-D、Bb03N-E、Ma09W-B、Pf01W-A;高弱毒性蛋白9种,分别为Bb36N-A、Bb36N-F、Bb06W-D、Bb06W-E、Bb29W-B、Ma09W-C、Ma09N-C、Pf01N-A、Pf01N-B。高毒性蛋白为Bb36W-C、Bb36W-D、Bb06N-C、Ma09N-A。对这4种高毒性蛋白的复筛生测,筛选出毒力最强的蛋白Bb36W-D,依据复筛结果,这4种蛋白毒性强弱依次为Bb36W-D、Bb36W-C、Bb06N-C、Ma09N-A。 松墨天牛幼虫经毒蛋白处理后,前期多表现为拒食,而后行动迟缓、不爱活动,在饲料中的钻蛀活动明显减少,多数时间停卧在饲料中不动,死亡前多从饲料中钻出,在饲料表面痉挛、抽搐,不久死亡。刚死亡的幼虫体色正常无明显症状,死亡后1~2天内虫体软化、变褐、变黑。有些试虫经毒蛋白处理后虽然末死亡但不能正常化蛹,化蛹为畸形,不能羽化,羽化出的成虫不正常。 毒性最强的蛋白Bb36W-D经SDS-PAGE电泳后解离为2个亚基,分子量较大的一个为大亚基,较小的一个为小亚基。经SDS-PAGE电泳测定,大亚基的分子量约为24kD,小亚基的分子量约为17kD;经等电聚焦电泳测定,大亚基的pI为9.59,小亚基的pI为9.40。该蛋白N-末端起始的5个氨基酸序列为:谷氨酸→脯氨酸→丝氨酸→异亮氨酸→缬氨酸。 蛋白Bb36W-D含17种氨基酸,碱性氨基酸含量较多,以精氨酸、组氨酸及丙氨酸含量较高,分别为0.13、0.12、0.11mg/mL,酸性氨基酸含量较少。 松墨天牛幼虫经Bb36W-D处理后其酯酶同工酶酶谱发生明显变化,酯酶谱增加1条E3酶带,减少1条E5酶带,E6酶带先变窄而后迅速变宽,其酶含量先下降而后迅速上升。毒蛋白Bb36W-D可明显引起松墨天牛幼虫的身体病变,而致其酯酶同工酶 发生了变化。 由上可见,从白僵菌中纯化出的胞外蛋白Bb36W一D对松墨天牛幼虫有很强的致病 性,其末端氨基酸序列己明确,应在此基础上对其进一步展开研究,根据其末端氨基 酸序列设计引物,扩增出该蛋白基因,然后转荃因育种,近而培育出抗松墨天牛的苗 木。
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