转lux基因发光乳球菌的构建及其生物学特性研究

【摘要】：发酵乳制品的免疫特性不仅与乳酸菌代谢产生的产物有关，而且与乳酸菌在肠道 中的粘着力、存活力和分布有关。然而，到目前为止，仍无有效方法能够检测乳酸菌 在肠道中的粘着力、存活力和分布，更无关于研究乳酸菌在肠道中的存活数量、粘着 力和发酵乳制品的免疫特性之间的关系的报道，其原因是动物体内乳酸菌的监测是非 常困难的。 本研究用转基因的方法构建出转 lux 基因发光乳球菌，并从利用转 lux 基因发光 菌进行乳酸菌活体检测的角度出发，对转 lux 基因发光乳球菌的构建方法和其生长特 性、产酸特性和发光特性及其这些生物学特性之间的关系进行了系统研究，并对利用 转 lux 基因发光菌的发光特开展益生菌的活体检测的可能性进行了讨论。研究得到如 下结果： 1. 用 SacI 和 PstI 酶切环形质粒 pMG36e 带有的多克隆位点后，可以使 lux 基因 插入，构建出重组质粒 pMG36e-luxAB 和 pMG36e-luxCDABE。 2. 当乳球菌浓度为 OD600=0.5-0.6 时，用含有 0.5mol/L 蔗糖和 10%甘油的洗液洗 涤后，在电击杯 0.2cm，电容 25μF，电压 2.0kV，电阻 200Ω，电场强度 20kV/cm， 时间 4.5-5.0 ms 的电击条件下可以将重组质粒 pMG36e-luxCDABE 和 pMG36e-luxAB 转入乳球菌中，使普通的乳球菌变成了带 lux 基因的发光乳球菌。这表明启动子 P32 可以在乳球菌中启动 lux 基因的转录。 3. lux 基因的转入并未显著影响乳球菌的主要生物学特性，因此，可以用转 lux 基因发光乳球菌的主要生物学特性推断普通乳球菌的主要生物学特性。 4. GM17e 固体培养时，转 lux 基因发光乳球菌在 40h 左右开始发光，46h 左右发 光强度达到最大，114h 左右失去发光特性。液体培养时放光强度在 5h 时最大，9h 后 基本消失。 5. 转 luxAB 基因发光乳球菌的发光强度显著高于转 luxCDABE 基因发光乳球菌 的发光强度；GM17 培养基培养时的发光强度显著高于 M17 培养基培养时的发光强 度；加红霉素的培养基培养时的发光强度显著高于未加红霉素培养基培养时的发光强 度；加红霉素的培养基培养时，转 lux 基因发光乳球菌的最大发光强度(RUL)达到 959759，其发光强度可能足以进行活体检测。 6. 无论转 luxCDABE 基因发光乳球菌和转 luxAB 基因发光乳球菌，在加红霉素 的培养基上有稳定的遗传特性，而在不加红霉素的培养基上培养时，只有 luxAB 基因 发光乳球中的 luxAB 基因具有稳定的遗传特性。 WP=6 摘 要 II 7. 用 GM17e 培养的转 luxAB 基因发光乳球菌 5h 达到最大发光强度时，即使将 环境 pH 值下降到 2.54 时，其 RLU 下降率不足 5%，而将环境 pH 值下降到 2.87 时， 转 luxCDABE 基因发光乳球菌的 RLU 下降率不足 20%。因此，用 GM17e 培养 5h 的 转 lux 基因发光乳球菌更有可能在低酸度的动物胃中发光。 MSRe 培养转 luxAB 基因发光乳球菌 5h 时发光强度达到最大时，用碱液使培养 液的 pH 升高时，其 RLU 不但没有下降，相而升高。因此，用 MRSe 培养的转 lux 基因发光乳球菌，更有可能用于中性或碱性环境中的乳球菌活性监测。 8. 即使转 lux 基因发光乳球菌随着培养时间的延迟逐渐失去发光特性后，调高培 养液 pH 值至 5.6 以上时则可恢复发光特性。因此，在动物活体中，当转 lux 基因发 光乳球菌在 pH 很低的胃中时可能暂时失去发光特性后，进入到 pH 值较高的肠道中 时，则有可能再次发光而进行活体检测。 9. 基因、培养基、红霉素和培养时间对转 lux 基因发光乳球菌的 RLU 极大影响。 但这些因素都可以控制。转 lux 基因发光乳球菌的 RLU 与培养时间和 OD 值之间存 在着极显著的相关性为利用转 lux 基因发光益生菌的 RLU 推断益生菌在活体内的生 存数量和质量提高了可能性。但培养时间对 RLU 值的极显著影响又为这种利用的可 能性增加了相当的难度。 本研究的创新之处 本研究的创新之处包括:提出了利用转 lux 基因菌进行乳酸菌活体检测的观念和 适于转入益生菌的带 luxAB 基因和 luxCDABE 的重组质粒的构建方法，将带 luxAB 基 因和 luxCDABE 基因的重组质粒转入乳球菌的方法，获得了稳定表达的转 luxAB 基因 乳球菌菌株和转 luxCDABE 基因乳球菌菌株，对转 lux 基因发光乳球菌的构建方法和 生物学特性及其这些特性之间的关系进行了系统研究。这些研究成果为今后利用转 lux 基因乳球菌进一步研究乳酸菌在人体内的生存数量、生活质量及其产物对人体益 生功能机理研究奠定了基础。 本研究的创新之处首先在于提出了利用转 lux 基因菌进行乳酸菌活体检测的观念 和方法，为在活体肠道中的对益生菌的生存力和粘着力的监测提供一种方法。正如“国 际食品研究杂志”(FOOD RESEARCH INTERNATIONAL )审稿时指出的(2004 年 2 月)：“该研究创建的生物发光报告基因菌株，将会为包括食品科学家在内的科学家提 供了一种在空间和时间上监测益生菌分布的方法，该方法还可以用于益生菌益生机理 的活体研究。在过去的 10 年，在生物发光基因菌的构建及其应用领域中有许多论文 发表，但主要是有关革兰氏阴性