昆虫病原线虫共生菌培养与活性研究

【摘要】：昆虫病原线虫共生菌是寄生于昆虫病原线虫肠道内的一类细菌,属肠杆菌科 (Enterobacteriaceae ),包括致病杆菌属(Xenorhabdus)和光杆状菌属(Photorhabdus),分别 与斯氏线虫属(Steinernema)和异小杆线虫属(Heterorhabditis)线虫共生。据报道, Xenorhabdus 和 Photorhabdus 能产生多种代谢产物,这些代谢产物不仅具有多种化学结 构,而且在医疗卫生和农业上具有广泛的生物活性,如抑菌、杀虫、杀线虫、抗溃疡、 抗肿瘤和抗病毒活性。特别是具有较高杀虫活性的胞外毒蛋白及其基因的发现,为生物 农药的开发和抗虫基因工程提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因。昆虫病原线虫共生 菌已成为一类新型的具有较大开发潜力和广泛应用前景的生物资源。关于昆虫病原线虫 共生菌的代谢产物及其生物活性已有较广泛的研究,但对于昆虫病原线虫共生菌的培养 发酵与次生代谢物产生关系的系统研究还是空白。因此,本研究以从陕西杨陵筛选的昆 虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 为材料,对其共生菌进行了 分离鉴定,并对共生菌的培养发酵与生物活性进行了系统的研究,现将结果总结如下。 1. 昆虫病原线虫 Steinernema sp YL001 和 Steinernema sp YL002 共生菌的形态及生 化特征分析表明,两种线虫共生菌的形态及生化特征分别与已描述的 X. nematophilus 和 X.bovienii 种的特征基本一致,将其分别定名为 X. nematophilus YL001 和 X.bovienii YL002。 2. X.nematophilus YL001 和 X.bovienii YL002 代谢物的生物活性研究表明,两菌株 对大蜡螟和粘虫具有较高的血腔毒性,处理 48h 两菌株在不同培养时间的无菌滤液对大 蜡螟的致死率均为 100%,粘虫的死亡率随共生菌培养时间的延长逐渐降低;对小菜蛾 和棉铃虫的胃毒活性较低;两株共生菌的血腔毒素可能主要是蛋白类物质。 室内活性测定结果表明,YL001 和 YL002 对供试的 14 种植物病原真菌和 5 种病原 细菌有不同程度的抑制作用。发酵液对烟草赤星菌、番茄早疫菌、南瓜枯萎菌、黄瓜炭 疽菌、稻瘟菌、小麦纹枯菌和辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,抑制率在 75～100%;无 菌滤液仅对辣椒疫霉菌有较强的抑制作用,稀释 10 倍后的抑制率为 100%,EC50 分别 为 16.3 ml/L 和 13.0 ml/L。盆栽实验表明,辣椒种子用 YL001 和 YL002 发酵液处理后, 辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为 60.6%和 73.2%;100ml/L 的发酵液处理土壤后, 辣椒幼苗的疫霉病病株减退率分别为为 48.72%和 74.34%,而甲霜灵的病株减退率为 64.10%。YL001 和 YL002 对水稻白叶枯菌和金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用,对大 肠杆菌和沙门氏菌抑制作用较弱。两菌株的抑菌活性物质对热较稳定,无菌滤液在 121 ℃(1.4Pa/cm2)处理 15min,对蜡状芽孢杆菌的抑菌圈直径较对照分别减小了 35.2%和 WP=6 摘 要 31.7%;无菌滤液 PH 在 8.0 左右时,抑菌活性较高。 3. 以抑菌圈直径和 DCW(干细胞重)为指标,筛选出 YL001 菌株的基础培养基 为 YSG 培养基。在 YSG 培养基的基础上,通过单因子分析表明,YL001 菌株的最佳碳 源为葡萄糖,最佳氮源为蛋白胨;玉米粉和豆饼粉可分别作为发酵培养基的碳源和氮源。 利用响应面优化设计分析法对 YL001 菌株的发酵动力学和发酵培养基进行了优化, 结果表明,氮源对 YL001 菌株代谢物抑菌活性的影响尤为显著;其发酵动力学和发酵 培养基的组成分别为(g/L): 葡萄糖 6.13、蛋白胨 21.29、MgSO41.50 、(NH4)2SO42.46、 KH2PO4 0.86 、K2HPO4 1.11、Na2SO4 1.72 和玉米粉 9.69、豆饼粉 51.57、棉饼粉 6.88、 鱼粉 13.75、酵母粉 4.30、MgSO41.07 、(NH4)2SO41.79、KH2PO40.63 、K2HPO40.80、 Na2SO41.25。 利用响应面优化设计分析法对 YL001 菌株的摇瓶发酵条件进行优化,结果表明, 摇床转速和装液量为影响发酵的主效因子,最佳摇瓶发酵条件为:PH 7.25、装液量 25ml/250ml 摇瓶、 摇床转速 220r/min、温度 26.2℃、接种量 9.1%。优化条件和初始条 件相比较,抑菌活性有了一定程度的提高,抑菌圈直径增大了 23.3 %,DCW 增加了 52.97% YL001 菌株的摇瓶发酵过程及发酵动力学特征分析表明,发酵 0～24h 是糖的利用 高峰,消耗了总糖的 83%,此阶段细胞生长较快,6h 细胞的比生长速率最大(0.21h-1), 生长量在 54h 达到最大(23.81g/L),抑菌物质的活性单位在 60h 达到最大(28.6U/ml)。 4. YL001 菌株在摇瓶中的逐级放大过程中,在相同的装液系数及摇床转速下,随 着摇瓶体积的增大,体积氧传递系数(KLa)逐渐增大;细胞生长量(X)、抑菌物质的 活性单位(P)和最大产物比合成速率(qp)逐渐减小;达到最大活性单位的时间逐渐 增大;最大细胞比生长速率(μmax)逐渐增大。摇瓶体积为 250ml 时,P、qp 、X 及 μmax 分别为 23.8 U.ml-1、0.27 h-1、15.7 g.L-1、和 0.16h-1较 3000ml 摇瓶分别增加了 39.2%、 70.4%、56.4%和减小了 30.4%。 从摇瓶到 7L 发酵罐的放大过程中,共生菌在发酵罐中培养时,在搅拌转速为 300r/min、通气量 2.5L/min 条件下,KLa 为 185.7 h-1,产物活性单位(P)为 23.2 U.ml-1 与摇瓶无明显差异(摇瓶培养条件:摇床转速 180r/min?