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《西北农林科技大学》 2004年
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表皮干细胞建系及重建角膜缘干细胞缺损眼表研究

杨学义  
【摘要】:自Bikenbach(1981)首次标记小鼠皮肤干细胞以来的二十余年间,科学家们对表皮干细胞进行了大量研究,但至今没有建立起表皮干细胞系的报道,从而制约了表皮干细胞研究的深入进行。开展分离纯化表皮干细胞建系及生物学特性研究,为表皮干细胞应于医学临床的组织工程及人类重大疾病的细胞治疗打下技术基础。该项研究不仅具有重要的理论意义,而且具有重要的临床应用价值,为无数正受烧伤、刀伤、各种溃烂煎熬及因患有皮肤癌及顽固性皮肤病而感到绝望的病人带来新为生活的希望。寻找可替代角膜缘干细胞的理想种子细胞构建组织工程化上皮,是治疗因疾病及各种理化因素导致双眼角膜缘干细胞缺损(limbal stem cell deficiency,LSCD)而致盲的病人的首要选择。表皮和角膜均来自外胚层,表皮干细胞(epidermal stem cells,ESCs)和角膜缘干细胞(limbal stem cells,LSCs)有相似的生物学特性。虽在胚胎发育过程中二者方向不同,但并不是不可逆的。本研究在总结、比较ESCs和LSCs生物学特性的基础上,借鉴成体干细胞可塑性的最新研究成果,提出以ESCs替代LSCs重建LSCD眼表的设想。进行了关中奶山羊表皮干细胞分离纯化、鉴定及体外诱导分化实验;以人羊膜为载体负载ESCs构建组织工程化角膜上皮,并进行了LSCD模型羊自体和同种异体移植。 1 山羊ESCs的分离纯化 取大小约0.5×0.5cm2山羊耳皮肤,切成0.2×0.2cm2大小的小块,按表皮面朝上贴于玻璃平皿(φ=5.5cm)中,每皿3~4块,进行组织块培养,每2d换液。经3~4d后,从组织块边缘长出上皮样细胞贴附生长,7~12d后,上皮样细胞铺路石样生长,在上皮样细胞层上有小圆形细胞聚集呈集落生长,约4.8d(n=11)后,这些集落直径达50μm~100μm,平均每组织块可得到原代克隆12.8个(n=11)。在解剖镜下挑取这些克隆,用0.25% Trypsin+0.02% EDTA进行适当处理,用玻璃细管将这些细胞吸入铺有明胶的3.5cm塑料皿中,用无血清培养基培养(已申报国家专利:200410025938.5),共传25代。经细胞形态学和动力学分析,单个干细胞培养9~12d可形成面积为0.8~1.5mm2 的全克隆,每个全克隆约有1500~2000个细胞。该类细胞直径约8~11um,分裂周期约28~30h,原代克隆形成率为58.9%。 2 山羊ESCs鉴定 免疫组化染色检测0~9代ESCs ,Oct-4、p63、K19、β1-integrin、α6-integrin、CD71、PCNA的表达特征。结果表明原代ESCs高表达 Oct-4,中度表达CD71、PCNA、K19,不表达β1-integrin、p63。Oct-4的表达随传代次数增加而下降,且需有滋养层细胞共培养维持;ESCs在明胶底物上单层生长时高表达p63、K19、β1-integrin、- WP=7 α6-integrin、CD71、PCNA。单个ESCs分裂分裂2个细胞时,一细胞Oct-4阳性,另一细胞阴性,这可能与干细胞不对称分裂有关。单个ESCs在明胶上长期培养能形成与在体相似的表皮增殖单位,并有毛囊形成;在含成纤维细胞、骨髓间质干细胞的凝胶上培养85d构建人工皮肤,经自体移植可部分修复重建急性皮肤创伤,并有毛发形成。透射电镜观察显示,人工皮肤分化细胞间有桥粒相连,表皮与基底膜间形成半桥粒,组织切片显示有毛囊形成。 3 山羊ESCs体外诱导分化 1)用2mM β-Me预诱导,1h后观察细胞呈圆形,有立体感。3h后从胞体长出细丝状突起,4h从胞体伸出的细丝更多更长,14h后,伸出的突起长出分枝,16h后改为正式诱导,正式诱导1h后,神经样纤维更长。48h后换神经细胞条件培养液,培养48h后,细胞连接呈网状,经免疫组织化学检测,诱导的神经细胞表达NSE、NF-200等神经细胞标志,诱导阳性率53.1%. 2)3μmol 5-Aza处理ESCs20h,用含心肌条件培养基的培养液培养,16d后有双核成纤维样细胞,细胞聚集成团生长,19d后观察到管状肌肉样结构形成。22d观察到有一细胞团出现微弱收缩,经免疫组化染色细胞团表达α-actin和myoglobin。54d其余细胞团固定进行光镜、电镜观察。组织学检测,诱导的心肌细胞团有类似正常心肌细胞形态,电镜观察显示,细胞内糖原颗粒增多,有大量肌丝形成,但未观察到闺盘样结构。 3)表皮干细胞在50μg/mL Vc 、50m mol/Lβ-磷酸甘油和1μmol/L地塞米松诱导20~24h后,细胞呈三角形或多角形成骨样细胞。不再增殖形成上皮样干细胞克隆,BCIP/NBT底物系统染色为阳性反应,细胞呈淡紫色。在染色后培养物中,可观察到细胞的各种形态,细胞密度较大处重叠,生长的细胞多呈梭形,在细胞密度较小处,单个成骨细胞呈典型的三角形或多边形,随着培养时间延长,细胞逐渐密集而重叠生长。21d时茜素红染色显示细胞结节阳性,表明所诱导的细胞有成骨细胞类似的形成钙沉淀的特征。扫描电镜观察细胞表面有明显的钙沉积。 4 羊膜负载ESCs构建组织工程化角膜上皮 表皮干细胞在羊膜上培养15~20min(37℃)就能贴壁,细胞仍呈圆形。低密度培养2~3d(1×105/ml),可见有界限清楚的克隆形成,5~7d细胞长成复层,经免疫组化染色,细胞层表面仍有p63,integrinβ-1阳性细胞。高密度时(1×107/mL),干细胞聚积生长而不分化,与表皮干细胞在3T3滋养层上生长行为类似。转为气液界面培养后,干细胞开始分化,三周后形成由扁平多角形细胞构成的复层上?
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