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《西北农林科技大学》 2004年
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已烯雌酚免疫分析的研究

陈德坤  
【摘要】:己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)属于人工合成的雌激素,在人和动 物体内会产生雌激素样效应。鉴于 DES 对人体的致癌和致畸作用,世界各国均规 定食品动物养殖中不得以任何途径和方式使用 DES,养殖动物及动物性食品中不 得检出 DES。DES 残留免疫分析是 DES 残留监控中的关键手段之一。项目对 DES 衍生物制备、DES 人工抗原合成、DES 多抗制备及检测方法、DES 单克隆抗体研 制等进行了研究。 建立了己烯雌酚半琥珀酸(DES-HS)的制备方法。避光条件下,以己烯雌酚 与一定量的丁二酸酐为原料在室温条件下于无水吡啶中搅拌 34h,酸性环境中静 置过夜,有浅棕色油状物析出,过滤,将得到的浅棕色沉淀减压蒸干,得粗产品。 将粗产品纯化后,经核磁共振、红外光谱、高分辨质谱鉴定。结果表明,该棕黄 色物质分子量为 368,分子式为 C22H24O5,含有酚羟基、羧基等关键基团,为所要 制备的 DES 衍生物己烯雌酚半琥珀酸(diethylstilbestrol hemisuccinate, DES-HS)。 应用混合酸酐法将 DES-HS 与载体蛋白(BSA,OVA)偶联,得到 DES 人工抗 原。 合成的人工抗原经紫外扫描、SDS-PAGE 凝胶电泳鉴定证明 DES-HS 与载体 蛋白偶联成功;并用 UVP Bioimaging system 中的 labworks 4.0 Image Acquisition and Analysis software 分析估算 BSA 与 DES-HS 的偶联率为 1﹕ 30~32,OVA 与 DES-HS 的偶联率为 1:25~28。 以合成的 DES-HS-BSA 免疫兔,经 6 次加强免疫后,用琼脂双扩散试验测定 免疫血清中 DES 抗体特异性及效价;探讨了间接 ELISA 测定 DES 抗体的条件;在 摸清免疫血清工作浓度的基础上,对免疫血清中 DES 抗体与游离 DES 的特异性结 合反应进行测定。结果显示,免疫血清在琼脂双扩散试验中能够和 DES-HS-OVA、 DES-HS-BSA 形成清晰的沉淀线,并且与 DES-HS-BSA 形成的沉淀线较粗,与 DES-HS-OVA 形成的沉淀线较细,琼脂双扩散试验测定出 DES 的抗体效价为 22.5~ 22.6;找出了间接 ELISA 测定 DES 抗体的最佳条件,即用 4μg/mL 的 0.1M pH9.6 的碳酸盐缓冲液包被酶标板过夜,1%的 OVA PBST 在 37℃封闭 1h,一抗、酶标二 抗的作用时间均为 45min,TMB 底物作用时间为 15min,终止液 H2SO4的浓度为 1M, 建立了间接 ELISA 测定 DES 抗体的方法;间接 ELISA 测定结果表明两组兔免疫血 清与 DES-HS-OVA 反应的 OD490nm值分别为 3.459±0.045、3.738±0.136,与 OVA 反应的 OD490nm值分别为 0.235±0.080、0.131±0.007;间接 ELISA 测定两组兔 免疫血清的 DES 抗体效价均达到 1:6000;在确定了免疫血清适宜稀释浓度为 WP=6 1:100 的基础上,间接阻断 ELISA 试验表明游离 DES 可以和免疫血清发生特异性 结合反应,并且随着游离 DES 加入量的增加,免疫血清中能够与 DES-HS-OVA 反 应的抗体量不断减少。上述结果证明用 DES-HS-BSA 免疫兔后,能够刺激兔免疫 系统产生抗 DES 决定簇的抗体,该抗体不仅能够特异性识别人工抗原 DES-HS-BSA、DES-HS-OVA 上的 DES 决定簇,还能够识别游离 DES 并与其发生特 异性结合反应。 用 DES-HS-BSA 免疫 Balb/c 小鼠 4 次后,间接 ELISA 测定免疫小鼠体内的 DES 抗体效价,13 只小鼠的抗体效价均在 1:8×103以上。取 2 只免疫效果最佳 小鼠的脾细胞,在 PEG 作用下与 SP2/0 细胞融合。经过筛选,3 次克隆化后,得 到 2 株生长稳定、DES 单抗分泌量较高的杂交瘤,分别命名为 3A8、4E6;分别对 两株单抗的细胞培养上清、腹水中 DES 抗体效价进行了测定,4E6 株细胞培养上 清、腹水中 DES 抗体效价分别为 1:6×104、1:1×107;3A8 株细胞培养上清、腹 水中 DES 抗体效价分别为 1:4×104、1: 1×107;用间接 ELISA 分别对 3A8、4E6 株培养上清中 DES 单抗的特异性进行了分析,两株杂交瘤分泌的单抗只与 DES 决定簇发生特异性结合反应。 本研究通过将 DES 转化为人工抗原,免疫兔、小鼠,成功地制备出了 DES 抗 血清和单克隆抗体,为研制拥有我国自主知识产权的 DES 残留免疫检测试剂盒提 供了一个良好的技术平台。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:S859.84

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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5 官杰;吴艳敏;王慧;钱丽丽;李殿俊;;壳寡糖协同双歧杆菌对荷瘤鼠免疫功能的影响[J];癌变.畸变.突变;2007年06期
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7 史冬燕;程在全;;元江普通野生稻金属硫蛋白基因的获得和序列分析[J];安徽大学学报(自然科学版);2009年03期
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10 鞠玉栋;郑回勇;吴维坚;陈永快;何炎森;吴松海;;中国水仙MADS-box基因克隆及其序列分析[J];安徽农学通报;2008年21期
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2 白华;苏红;李靖冉;齐静;胡明;骆延波;朱小玲;刘玉庆;吴聪明;;新型吸管式药敏检测盒的应用及山东省动物源病原菌抗药性监测网络的构建[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
3 梁权;毛培菊;罗春贞;王缦;;HIV-1跨膜蛋白gp41的截短表达及其免疫反应性[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
4 朱勤勋;严雪;韩友斌;;鼠源IgG抗体F(ab')2片段及Fab片段的制备纯化及其免疫活性研究[A];第五次全国免疫诊断暨疫苗学术研讨会论文汇编[C];2011年
5 傅志泉;李珍;黄巧玲;李春霞;杨丽姣;;和胃口服液对慢性萎缩性胃炎大鼠免疫功能影响的实验研究[A];庆祝浙江省中西医结合学会成立三十周年论文集粹2011[C];2011年
6 朱美财;占志;王雅静;蔡庆;;刺桐胰蛋白酶抑制剂突变体在大肠杆菌中的表达及在TPA纯化中的应用[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
7 许道艳;刘仁沿;李伟;梁玉波;;酶联免疫吸附法分析失去记忆性贝毒ASP[A];有毒化学污染物监测与风险管理技术交流研讨会论文集[C];2008年
8 刘俊莹;张华鹏;王聪聪;张剑峰;;马铃薯卷叶病毒ORF1克隆及序列分析[A];马铃薯产业与科技扶贫(2011)[C];2011年
9 冯琦;孙秉中;赵永同;孙凯;张英起;颜真;韩苇;;Bcr-abl特异性系列核酶载体的构建及初步鉴定[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
10 白玉杰;苏成芳;杨安刚;;抗人CD3单链抗体基因的构建及表达[A];生命科学与生物技术:中国科协第三届青年学术年会论文集[C];1998年
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3 王庆莲;苹果多胺和脯氨酸合成代谢相关基因的功能鉴定[D];山东农业大学;2009年
4 郭爱疆;猪带绦虫六钩蚴TSOL18抗原表位及组织定位的研究[D];甘肃农业大学;2010年
5 郑小坚;家蚕类胰岛素基因BBX-B8的功能研究[D];苏州大学;2010年
6 韩瑞玲;鱼精蛋白包覆PLGA纳米粒用于疫苗载体的初步研究[D];华中科技大学;2010年
7 王发明;柚(citrus grandis Osbeck)单染色体AFLP分子标记体系及文库的建立[D];福建农林大学;2010年
8 刘春;梅毒免疫相关基因的单核苷酸多态性研究[D];北京协和医学院;2010年
9 于蕾;野西瓜极性生物碱A10组分诱导SGC-7901细胞凋亡线粒体通路的研究[D];北京中医药大学;2010年
10 熊义;IRES调控α-干扰素的抗FMDV研究[D];武汉大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 曲丽洁;用于动物性食品中莱克多巴胺快速检测的SPR技术研究[D];华中农业大学;2010年
2 周晓芬;金黄色葡萄球菌肠毒素B作为免疫佐剂的研究[D];华中农业大学;2010年
3 韩秀萍;幽门螺杆菌基因敲除方法的建立及其应用研究[D];华中农业大学;2010年
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5 陆健康;抗玉米赤霉烯酮和抗脱氧雪腐镰刀菌烯醇抗体的制备及性质分析[D];华中农业大学;2010年
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7 冯倩倩;赭曲霉毒素A人工抗原构建及其多克隆抗体的制备[D];华中农业大学;2010年
8 王云;鸡胸腺发育形态学研究[D];华中农业大学;2010年
9 余姣姣;天蓝放线紫红素生物合成上调基因的克隆及其对阿维菌素产量的影响[D];华中农业大学;2010年
10 徐娟;T-2毒素多克隆抗体的制备及其化学发光免疫检测的初步研究[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
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1 曹光荣,李绍君,段得贤,赵效文,Russell J.Molyneux;黄花棘豆有毒成分的分离与鉴定[J];西北农林科技大学学报(自然科学版);1989年03期
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中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 童德文;苦马豆素—BSA的合成及其免疫原性研究[D];西北农林科技大学;2000年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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1 吴达;甘肃棘豆生物碱抗肝癌活性及其对荷瘤小鼠免疫功能影响的研究[D];西北农林科技大学;2010年
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1 张伟;豆类丝核菌次级代谢产物对小鼠生殖毒性的研究[D];西北农林科技大学;2009年
2 郭卫华;豆类丝核菌次级代谢产物对化疗致骨髓抑制的保护及对肝肾功能的影响[D];西北农林科技大学;2009年
3 朱超;豆类丝核菌次级代谢产物对免疫抑制小鼠免疫功能的影响[D];西北农林科技大学;2010年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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5 何继红,沈建忠,侯晓林;多拉菌素人工抗原的制备与鉴定[J];中国兽医杂志;2005年01期
6 古艳丽;曲志娜;陈德坤;郑增忍;路平;刘爽;李葳;张桂金;谭维泉;;己烯雌酚人工抗原的合成和酶免疫检测方法的建立[J];中国农学通报;2006年09期
7 雷红涛;肖治理;方坚生;沈玉栋;刘文字;孙远明;冯伟雯;;丁草胺人工抗原及抗体制备研究[J];食品科学;2007年10期
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10 滑静;徐修远;孙英健;于同泉;;氯霉素人工抗原的合成与鉴定[A];动物生理生化学分会第八次学术会议暨全国反刍动物营养生理生化第三次学术研讨会论文摘要汇编[C];2004年
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1 陈德坤;已烯雌酚免疫分析的研究[D];西北农林科技大学;2004年
2 雷红宇;圆弧青霉菌毒素—青霉酸的单克隆抗体及免疫毒理学研究[D];湖南农业大学;2009年
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4 杨泽晓;醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体及ELISA检测技术研究[D];西北农林科技大学;2008年
5 王自良;苯巴比妥残留免疫学快速检测技术研究[D];西北农林科技大学;2006年
6 宋毓民;SW-BSA人工合成抗原疫苗的研究[D];西北农林科技大学;2009年
7 王爱华;苦马豆素人工抗原的合成及其免疫原性研究[D];西北农林科技大学;2008年
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9 杨润亚;苦皮藤素Ⅴ免疫分析技术的研究[D];西北农林科技大学;2002年
10 范国英;链霉素残留免疫学快速检测技术研究[D];西北农林科技大学;2007年
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1 印晓梅;新型三唑类小分子人工抗原的合成[D];南京中医药大学;2013年
2 李蓉;两种斑蝥素人工抗原的合成及其多克隆抗体制备研究[D];西北农林科技大学;2011年
3 陈婷婷;计算机模拟辅助氯霉素人工抗原的设计与合成[D];南昌大学;2011年
4 成红;新霉素人工抗原的制备及鉴定[D];郑州大学;2013年
5 李华;脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)人工抗原的合成及其酶联免疫检测方法的建立[D];南京农业大学;2003年
6 陈臣;重金属铅人工抗原的制备与纯化及抗体免疫检测体系的建立[D];南昌大学;2012年
7 李嘉嘉;土霉素单克隆抗体的制备[D];河南科技大学;2012年
8 周兰香;SMD人工抗原的制备研究[D];扬州大学;2001年
9 雷莉辉;已烯雌酚人工抗原的研究[D];西北农林科技大学;2004年
10 刘喜保;有机磷多残留免疫检测分析研究[D];西北农林科技大学;2012年
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