杂交水稻冈优527品种真实性和纯度的SSR检测方法

【摘要】：稻瘟病(Rice blast disease)是水稻上的三大病害之一,每年都在世界范围 内造成重大损失。1995 年,四川农业大学水稻研究所用蜀恢527 和冈46A 配组 育成了杂交水稻品种冈优527,该品种除具有米质好,产量高等优点之外,还具 有高度的抗瘟性,在生产上连续应用8 年仍表现稳定高抗,深受农民欢迎。 冈优527 种子的真实性及纯度是影响其抗病性的重要因素。对冈优527 种子 真实性和纯度的检测是保证其抗病性一致及提高产量的一项必要措施。 微卫星标记在真核生物基因组上的分布广泛而均匀,具有多态性丰富,稳定 性好,操作方便,重复性高等特点,是遗传多样性分析、DNA 指纹图谱构建以 及品种鉴定的理想方法。 本实验搜集了24 种杂交稻,对分布于水稻12 条染色体上的51 个微卫星位 点进行PCR 扩增,寻找对冈优527 特异的微卫星位点,最终筛选出一对引物 RM341,经PCR 扩增和2.0%琼脂糖凝胶电泳可以看出,在RM341 扩增出的两 条带中,冈优527 有一条带的大小明显不同于其他杂交稻品种。我们又将其与几 种栽培稻做了对比,发现栽培稻的扩增产物只表现为一条带。为验证该位点用于 品系鉴定和纯度检测的可靠性,我们做了掺杂实验,成功地检测出了冈优527 中人为掺加的几粒种子。 本实验还尝试建立荧光检测体系,采用ABI 310 型DNA 分析仪和荧光标记 的引物来扩增SSR 位点,用毛细管电泳和相应分析软件分析扩增结果。该方法 具有高灵敏度,高通量、半自动化操作的优点。但是,经克隆测序,我们发现该 荧光检测系统并不很精确,存在2～4 个碱基的误差。虽然由于冈优527 的特异 性片段与其他品种的条带差别比较大(20bp 左右),该方法的误差不会影响对冈 优527 检测结果的判断,但是,它毕竟不能作为一个通用的方法体系应用于实际 检测之中。 本文还对该位点的测序结果进行了分析,探讨应用实时荧光PCR 技术进行 杂交水稻品种真实性检测及纯度测定的可行性。分析结果表明,微卫星位点两端 也可能存在一些特异性的序列,可以用来设计荧光探针,而且在一定条件下,利 用微卫星的长度多态性也可以设计荧光探针。但是,由于微卫星结构的特殊性, 这种探针是否能正常发挥它的工作效率还是一个值得怀疑的问题。 本研究为进一步探讨冈优527 品种的种子纯度与大田抗病性表现的相关关 系奠定了基础。