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豆类丝核菌次级代谢产物的生物效应研究

张黎  
【摘要】:目的:筛选出生长稳定,产生SW量大的优良的豆类丝核菌菌株,为该菌进行发酵动力学研究奠定基础,并获得该菌在生长及形态上的系统鉴定资料;同时研究该菌的次级代谢产物的抗肿瘤病理及免疫效应,从而探索SW的抗肿瘤应用;探索该菌或其次级代谢产物的动植物损害在细胞生物学上的关系,从而为SW的毒理学研究及肿瘤病理学研究提供新的研究思路。 方法:①通过野外分离和保存菌株复活纯化方法,获得生长稳定的豆类丝核菌,并进通过光学显微镜和扫描电镜进行形态学鉴定,对不同菌株分别与标准菌和相互进行菌丝融合试验。②将筛选分离的稳定菌株用改良的Czapek’s培养基进行培养,获得豆类丝核菌次级代谢产物,并通过气相色谱法测定其苦马豆素(Swainsonine,SW)含量。③通过建立种植性肝癌(H22)实体瘤动物模型,并给荷瘤小鼠灌胃含有SW且剂量分别为2.7/mg/kg/d(Ⅱ组)和16.2mg/kg/d(Ⅲ组)的豆类丝核菌次级代谢产物稀释液,分别于不同时间测定荷瘤鼠T淋巴细胞活化指数(SI)、肿瘤抑制率和腹腔巨噬细胞吞噬百分率和剖检荷瘤动物并取肿瘤组织与肝组织进行病理组织学和电镜观察。④制作豆类丝核菌次级代谢产物污染的饲料和人工污染豆类丝核菌饲料,饲喂家兔17d ,剖检家兔并取其脑、肝脏、肾脏等组织分别进行病理组织学和电镜观察;同时将不同浓度的次级代谢产物和不同株的豆类丝核菌分别污染回接的绿豆,待84h培养后,分别进行组织学和电镜观察。 结果与小结:① 获得6株生长稳定的菌株,且6株菌属于同一菌种的不同融合群,均具有豆类丝核菌的形态特征,属于豆类丝核菌,其产生的次级代谢产物中含有大量的SW,02-6B和02-3A代谢产生的 SW 较高,分别达到1 093.17 mg·L-1和1 199.64 mg·L-1。②在抗肿瘤试验中,Ⅲ组SI在8d时显著升高,明显高于对照组(Ⅰ组)的1.333±0.053,达到1.670±0.527(P0.05)。Ⅲ组荷瘤动物腹腔巨噬细胞吞噬率在灌药后8d时也显著高于肿瘤对照组(Ⅰ组)的腹腔巨噬细胞吞噬率(P0.05),达到33.99±1.56%。Ⅱ、Ⅲ两组肿瘤抑制率8d时分别为26.44%和33.91%,16d时分别为46.98%和47.24%。Ⅱ组与Ⅲ组在8、16d时肿瘤细胞出现大量且严重的脂肪变性及大面积坏死,且坏死区呈网络状,将瘤组织分割成小的瘤细胞团。表明该次级代谢产物能够使荷瘤动物细胞免疫应答增强,并能抑制种植性实体瘤(H22)的生长和转移;其中含SW16.2mg/kg/d剂量标准的次级代谢产物对荷瘤动物的免疫增强作用与抗肿瘤作用明显。③在对动植物细胞损害作用中,豆类丝核菌次级代谢产物使家兔脑组织和淋巴细胞空泡变性,神经细胞核糖体脱颗粒,粗面内质网扩张等;同时能使植物根部组织结构受 WP=6 损,细胞空泡变性,内膜破裂等。由此表明,豆类丝核菌引起的动物中毒作用主要是其次级代谢产物中SW发挥毒性,且同疯草中毒引起的病理变化基本一致;菌株对植物根部的致病性与其次级代谢产物中SW含量呈正相关。即推测,SW很有可能不仅是动物豆类丝核菌中毒的主要毒素,而且是豆科植物丝核菌病中细胞损害的主要化学物质。


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