AEV结构蛋白基因的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【摘要】：根据已发表的禽脑脊髓炎病毒1143株特异性结构蛋白VP0、VP1、VP3基因序列,分别设计三对引物,利用反转录—聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,在体外从AEVVan-Roekel株感染的SPF鸡胚胚脑和内脏器官组织中成功扩增出各结构基因片段。将其回收、纯化后,以VP0、VP1、VP3基因连接到线状克隆载体PMD18-Teasy Vector,转化JM109感受态细胞。在含氨苄青霉素的LB平板上筛选阳性克隆,扩大培养,提取质粒,经酶切和PCR鉴定,取阳性质粒用Sangers双脱氧末端终止法对核酸序列进行测定,推算其氨基酸序列;并将其与已发表的AEV 1143株相关基因以及小RNA病毒科其它病毒属在对应位置的核苷酸和氨基酸的同源性进行比较、分析。 将VP0基因克隆到原核高效表达载体PET30α,构建重组表达质粒PET30α-VP0,转化PET30α表达宿主菌BL21;经IPTG和42℃升温诱导表达,收获菌体沉淀,经菌体全细胞裂解和提取包涵体后进行SDS-PAGE和Western-blot电泳分析表明,重组质粒能在大肠杆菌中获得表达,表达产物主要以包涵体形式存在于菌体中。蛋白印迹试验检测表达蛋白分子量PET-VP0为52Ku;经薄层扫描测定,蛋白相对含量为26.3%。上述表达产物能与AEV阳性血清发生特异性反应。