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《西北农林科技大学》 2005年
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西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因5’侧序列克隆和分析及乳腺特异性表达载体的构建

朱婧  
【摘要】:乳腺生物反应器(Mammary G1and Bioreactor,MGB)是一种高效率蛋白质合成器官,它可以利用转基因动物的乳腺组织生产基因工程药用蛋白。采用基因工程技术在动物乳腺生产有药用价值的蛋白质和多肽,具有产量高、成本低和产品质量好等优点。目前常用的转基因动物有猪、羊、牛,它们的泌乳量大,活性蛋白的产量高,且乳液容易收集。因此,转基因动物乳腺生物反应器就像一座生产活性蛋白的药物工厂,能够源源不断地生产出人类所需的药用蛋白。 本研究采用PCR 技术从西农萨能奶山羊基因组中扩增出?-酪蛋白基因5'侧序列。将该序列克隆入pMD18-T 载体,并对其进行序列测定,表明克隆得到西农萨能奶山羊β-酪蛋白基因-4359-+2106bp 区,共6,465 bp 的序列。生物信息学分析显示:该序列与已公布的其它山羊β-酪蛋白基因序列具有极高同源性(96%~98%),包含有TATA启动子序列和HOXF、Oct-1、AP1、CEBP、STAT、NFKB、GR、ER、PR、ETS 等转录因子识别位点,该序列保留了β-酪蛋白第一内含子、第一外显子和第二外显子及其信号肽部分。将此6,465 bp 片段插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic 中,构建载体pGL3/B65。瞬时转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,48 h 后检测显示,该5'侧序列具有启动子和增强子活性,对促乳素发生应答。随后将?-酪蛋白基因5'侧序列克隆到pcDNA3.1(-)中,构建了乳腺特异性表达载体pcDNA3.1-65。又将hBMP2 的cDNA,克隆到pcDNA3.1-65 中,构建了hBMP2 乳腺表达载体pcDNA3.1-65-hBMP2,转染原代培养的西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,促乳素诱导48h 后,hBMP2 的免疫细胞化学染色呈阳性反应,荧光颗粒主要见于细胞浆内,呈弥漫及团状分布,胞核淡染,对照组的胞浆内染色颗粒消失或较弱。Western blotting显示,已转染pcDNA3.1-65-hBMP2 载体并经促乳素诱导的乳腺上皮细胞裂解液中hBMP2 蛋白条带明显存在,未经促乳素诱导则hBMP2 蛋白带明显减弱;而转染pcDNA3.1(-)、pcDNA3.1-65 载体的细胞在同样位置未见蛋白条带。相关研究结果如下: 1.克隆了西农萨能奶山羊?-酪蛋白基因5'侧序列,共6,465bp 的片段, 所测序列已登录GenBank,GenBank Accession No. AY834229。用启动子和增强子捕获实验检测,证明所克隆的6,465bp 的序列具有启动子和增强子元件。 2.利用该5'侧序列构建了乳腺特异性表达载体pcDNA3.1-65,并将hBMP2的cDNA片断克隆入该载体,初步用西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞检测,证明该载体能受促乳素诱导而表达hBMP2,为进一步建立转基因动物乳腺生物反应器奠定了基础。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:S827;Q78

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