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《西北农林科技大学》 2005年
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热稳定性β-半乳糖苷酶工程菌构建及其培养条件优化

祁艳霞  
【摘要】:本研究利用基因重组技术构建热稳定性β-半乳糖苷酶基因工程菌,并对筛选获得的工程菌优化培养条件。通过试验获得如下主要结果:  1.将枯草芽孢杆菌生孢子早期因子spo0A基因整合载体pGJ09和pGJ16分别以双交叉和单交叉同源重组方式整合到枯草芽孢杆菌野生株1A747 中,得到spo0A 基因突变株BGJ09-5 和BGJ16-3。通过PCR、酶切检测BGJ09-5 的spo0A 基因完全敲除,生孢子培养结果完全丧失生孢子能力,并且BGJ09-5 生长速度受到严重抑制,而BGJ16-3 是在spo0A 基因位点插入一段新霉素抗性基因,其仍具有生孢子能力,但相对阴性对照野生株1A747 生孢子速度慢。  2.热稳定性β-半乳糖苷酶基因表达载体pGJ222 电转化野生菌1A747、突变株BGJ16-3和BGJ09-5,得到转化子BGJ222 和BGJ222-16。对BGJ222 和BGJ222-16 表达β-半乳糖苷酶的情况进行研究,发现BGJ222 比突变株BGJ222-16 表达β-半乳糖苷酶的能力强。  3.将获得的BGJ222 进行发酵培养,筛选出最佳培养基配方及发酵工艺参数为:1%蛋白胨(Trypton)、1%酵母抽提物(Yeast extract)、1%山梨醇(D-Soribitol)、1%乳糖(Lactose)、1.3%Na2HPO4·12H2O、1%NaH2PO4·2H2O,灭菌前调PH 值为6.6;发酵工艺参数为250ml 三角瓶装液量30ml、接种量2%、温度37℃、转速225rpm/min。  4.由于表达载体是枯草芽孢杆菌麦芽糖启动子pglvA,在发酵培养6h时以终浓度3%的麦芽糖诱导,培养28h 时收集初酶液最佳。此时β-半乳糖苷酶表达量达到22992.7 miller unit,比初始时在LB 中的最高表达量860.3 miller unit 提高了27 倍。由于葡萄糖的碳分解阻遏作用对麦芽糖启动子转录活性的抑制,本试验初步探讨了发酵液中的葡萄糖含量对启动子转录活性的的影响,发现当发酵液中的葡萄糖含量小于0.3mg/ml 时葡萄糖抑制被解除,β-半乳糖苷酶开始大量表达。  
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q78

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