收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

果蝇抗菌肽基因Andropin在大肠杆菌中的克隆与融合表达

刘变芳  
【摘要】:基于抗菌肽结构与功能的关系及前人所做的融合基因工作,本研究设计、合成了大小为34个氨基酸的果蝇抗菌肽基因(Andropin)片段,克隆到T-easy vector保存。随后选择E. coli高效融合表达载体pET32a连接目的片段,并转染到大肠杆菌OrigammiB中进行表达。表达的融合蛋白经His-Tag亲和层析纯化和EK酶切后,对其产物进行活性检测。 1.实验中采用化学合成法合成了含有互补区的两个目的片段和两个引物,结合重叠区互补PCR法扩增得到完整的Andropin基因片段,将其克隆到T-easy vector上,测序正确。基因设计时除了加入合适限制性内切酶位点,在目的片段前加入了肠激酶切位点。这将便于载体选用和后续酶切纯化。 2.实验构建了融合表达载体PET32a-Anp,PCR初步检测筛选阳性转化子,进一步测序正确。选用OrigammiB宿主菌进行转染,并从温度、诱导时间设置不同条件,摸索最佳组合,提高表达量。降低培养温度、延长诱导时间提高表达产物的可溶性。试验结果表明转基因大肠杆菌的最佳培养温度37℃,摇床培养3h后加入诱导剂。诱导温度25℃, 1mM IPTG诱导条件下,6h即可达到表达高峰,融合蛋白的表达量可占总蛋白的20-30%,表达产物的分子量约为28KD。 3.对基因工程重组菌进行大量诱导表达,超声波处理参数:超声处理30s,间歇30s,工作12个循环。12000rpm,30min低温高速离心,取上清用His-Tag purify -cation kit亲和层析纯化,将纯化的融合蛋白缓冲液进行透析后,用肠激酶切割。SDS-PAGE电泳结果表明表达产物可溶性达70%以上。抗菌活性试验表明表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌作用。对革兰氏阴性菌作用比革兰氏阳性菌明显。 本研究为抗菌肽的生产提供了一条重要的途径,并为进一步研究抗菌肽的生产表达、结构与功能、抗菌的特性、改造已有的抗菌肽、设计新型的抗菌肽药物奠定了基础。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 赵亚华;徐来祥;张建军;黄蓬亮;许少鹏;宋铭晶;;大肠杆菌中融合表达人β防御素-3基因的研究(英文)[J];中国比较医学杂志;2007年11期
2 曲朝杰;苗向阳;朱瑞良;张鑫;;抗菌肽的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2009年07期
3 崔奕;王平;黄赤夫;;抗菌肽的基因工程研究及应用[J];中南林业科技大学学报;2011年07期
4 张召兄;潘晓亮;任耀军;;抗菌肽概述及抗菌分子机理的研究进展[J];草食家畜;2006年04期
5 储卫华;李大力;汪信;;抗菌肽基因在毕赤酵母中分泌表达及其条件优化[J];农业生物技术学报;2006年06期
6 林承德;彭鸿娟;王衍海;;抗菌肽的应用及存在的问题[J];热带医学杂志;2007年01期
7 李敏惠;杨平;何正波;;昆虫抗菌肽及其基因工程研究进展[J];应用与环境生物学报;2006年03期
8 黄莹;张守纯;赵越;张哲;张宇;赵旭;;抗菌肽基因工程研究进展及其在畜牧生产体系中的应用[J];安徽农业科学;2007年30期
9 王德成;佘敏;佘锐萍;李文贵;王英华;孙泉;;抗菌肽的构效关系及其基因表达调控的研究进展[J];中国兽医科学;2008年03期
10 杨学明;江林源;蒋和生;;水生动物抗菌肽及其基因工程研究[J];生物技术通讯;2006年01期
11 魏艳彬;王洪法;;抗菌肽的研究进展[J];中国现代医生;2009年15期
12 徐建华;朱家勇;金小宝;许琴英;;抗菌肽Cecropin-His-6基因的真核表达及其生物活性研究[J];中国热带医学;2006年07期
13 许晓玲;王敏奇;;抗菌肽生物活性的影响因素、作用机制及其基因表达调控[J];中国饲料;2008年07期
14 唐勇;;抗菌肽基因表达系统研究进展[J];饲料工业;2009年07期
15 孔卫青;杨金宏;;家蚕moricin基因家族的诱导表达[J];安徽农业科学;2009年19期
16 马玻;张玉明;倪志华;周艳芬;;抗菌肽的结构与功能研究[J];安徽农业科学;2009年23期
17 卢其能;罗晓明;江辉;邹一平;;抗菌肽的研究进展[J];江西科学;2007年04期
18 张丽芳;;抗菌肽原核表达策略[J];黑龙江科技信息;2010年06期
19 张鑫;尹逊河;苗向阳;曲朝杰;张秋婷;马艳芳;;抗菌肽Thanatin转基因小鼠建立的初步研究[J];中国兽医学报;2010年03期
20 党晓伟;李梦云;常娟;尹清强;左瑞雨;王平;王朋朋;;猪Hepcidin基因的克隆与序列分析[J];江西农业学报;2010年06期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 汪以真;韩菲菲;;猪源抗菌肽抗菌、免疫、表达特性及其营养调控的研究进展[A];饲料营养研究进展(2010)[C];2010年
2 尚德静;白冰;李晓帆;付欣;郑俊杰;;中国林蛙(Rana chensinensis)皮肤抗菌肽基因和功能多样性研究[A];“基因、进化与生理功能多样性”海内外学术研讨会暨中国生理学会第七届比较生理学学术会议论文摘要[C];2009年
3 徐家萍;王成林;杨莹;尤征英;;多功能抗菌肽及其分子改造的研究进展[A];华东·华中地区第十二次蚕种学术研讨会论文集[C];2010年
4 韩海燕;徐兴然;陈力;杨艳;李华冲;唐光霞;杨大成;;含酰胺键克林沙星衍生物的简易合成法研究[A];有机合成创新—产业化的新动力——中国化学会全国第三届有机合成化学与过程学术讨论会论文摘要集[C];2010年
5 谈满良;周立刚;汪冶;王敬国;;桃金娘科植物抗菌成分的研究进展[A];中国植物病理学第七届青年学术讨论会论文集[C];2005年
6 陈绍平;颜其贵;;抗菌肽抗菌活性的研究进展[A];第四届第九次全国学术研讨会暨饲料和动物源食品安全战略论坛论文集(下册)[C];2008年
7 廖文艳;马得莹;;重组鸡β-防御素10蛋白的原核表达及其理化特性的分析[A];中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十次学术研讨会论文集[C];2008年
8 柯涛;毛晗;董彩华;郭学兰;黄思良;刘胜毅;;油菜抗菌肽基因的生物信息学分析[A];基因开启未来:新时代的遗传学与科技进步——湖北省遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编[C];2009年
9 许旭萍;李惠珍;谢华玲;;柱状田头菇有效成分及抗菌活性的研究[A];全国第6届食用菌学术研讨会论文集[C];2001年
10 潘洁茹;张鸿声;邱君志;关雄;;座壳孢菌Jos009次生代谢产物活性研究[A];中国农业生物技术学会第三届会员代表大会暨学术交流会论文摘要集[C];2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 黄金丰;α-螺旋型膜活性多肽对不同细胞膜的构效关系及作用机理研究[D];吉林大学;2011年
2 丁云超;鱼类卵黄高磷蛋白衍生抗菌肽的免疫调节功能的研究[D];中国海洋大学;2012年
3 温武军;鲤抗菌肽基因的克隆及其功能研究[D];山东师范大学;2011年
4 蔡照胜;季铵化羧烷基壳聚糖的制备、结构和性能研究[D];中国林业科学研究院;2009年
5 王占良;水杨醛衍生物缩丙二胺Schiff碱金属配合物的合成、表征和性质研究[D];东北师范大学;2008年
6 黄勋;无机抗菌复合材料的制备、抗菌活性及其抗菌机理研究[D];中南大学;2007年
7 刘小莉;银杏内生真菌分离鉴定及其抗菌抗氧化作用研究[D];南京农业大学;2007年
8 何跃君;竹叶挥发油化学成分及其生物活性研究[D];中国林业科学研究院;2009年
9 孙龙;两种鞘翅目昆虫抗菌肽的分离纯化与活性研究[D];中国林业科学研究院;2012年
10 王芳;高蛋白海洋解脂耶罗维亚酵母遗传改良以及表达重组抗菌肽的研究[D];中国海洋大学;2011年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘变芳;果蝇抗菌肽基因Andropin在大肠杆菌中的克隆与融合表达[D];西北农林科技大学;2005年
2 高飞;抗菌肽快速筛选方法与抗菌活性的研究[D];江南大学;2011年
3 卢帅;抗菌肽Dermadistinctin串联表达载体的构建及表达产物抗菌活性研究[D];湖南农业大学;2010年
4 宋涛;奶牛血液红细胞抗菌肽的分离与纯化[D];河南科技学院;2010年
5 黄平;草鱼肠道抗菌肽分离纯化及部分理化性质的研究[D];中南林业科技大学;2009年
6 谭娟娟;抗菌肽的构效关系与活性机理的研究[D];吉林大学;2012年
7 谷素美;牛血白细胞抗菌肽的粗提取及防腐保藏功效检测[D];河南农业大学;2012年
8 侯恩娟;酪蛋白抗菌肽的制备与研究[D];西华大学;2010年
9 潘朋朋;光滑爪蟾皮肤抗菌肽的分离纯化及生物活性的鉴定[D];吉林大学;2012年
10 张守庆;重组对虾素3-2微胶囊制备及释放特征的研究[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 曹继军 通讯员 赵如江;我科学家首次发现附睾中一种抗菌肽基因[N];光明日报;2001年
2 张学全;我国生命科学研究领域取得重大突破[N];中国医药报;2001年
3 孙新花;鲁抗首个第四代头孢强势招商[N];医药经济报;2006年
4 广文;探索“灵素”的轨迹[N];医药经济报;2007年
5 高强;新型兽用抗菌药物——沃尼妙林[N];中国畜牧兽医报;2008年
6 上海天祥质量技术服务有限公司 吴颖 王建平;抗菌性纺织品的评价方法与标准(上)[N];中国纺织报;2007年
7 ;头孢菌素类抗生素的应用(一)[N];农村医药报(汉);2007年
8 暨南大学医药生物技术研究开发中心 郑青博士后;抗菌肽 前景广阔的新型抗生素[N];医药经济报;2001年
9 山东畜牧兽医职业学院 杨瑞锋;用精准“组方”攻克禽“顽疾”[N];中国畜牧兽医报;2007年
10 穗金点;推陈出新品种多——喹诺酮类仍是抗菌药主流[N];中国医药报;2006年
中国知网广告投放
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978