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《西北农林科技大学》 2005年
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果蝇抗菌肽基因Andropin在大肠杆菌中的克隆与融合表达

刘变芳  
【摘要】:基于抗菌肽结构与功能的关系及前人所做的融合基因工作,本研究设计、合成了大小为34个氨基酸的果蝇抗菌肽基因(Andropin)片段,克隆到T-easy vector保存。随后选择E. coli高效融合表达载体pET32a连接目的片段,并转染到大肠杆菌OrigammiB中进行表达。表达的融合蛋白经His-Tag亲和层析纯化和EK酶切后,对其产物进行活性检测。 1.实验中采用化学合成法合成了含有互补区的两个目的片段和两个引物,结合重叠区互补PCR法扩增得到完整的Andropin基因片段,将其克隆到T-easy vector上,测序正确。基因设计时除了加入合适限制性内切酶位点,在目的片段前加入了肠激酶切位点。这将便于载体选用和后续酶切纯化。 2.实验构建了融合表达载体PET32a-Anp,PCR初步检测筛选阳性转化子,进一步测序正确。选用OrigammiB宿主菌进行转染,并从温度、诱导时间设置不同条件,摸索最佳组合,提高表达量。降低培养温度、延长诱导时间提高表达产物的可溶性。试验结果表明转基因大肠杆菌的最佳培养温度37℃,摇床培养3h后加入诱导剂。诱导温度25℃, 1mM IPTG诱导条件下,6h即可达到表达高峰,融合蛋白的表达量可占总蛋白的20-30%,表达产物的分子量约为28KD。 3.对基因工程重组菌进行大量诱导表达,超声波处理参数:超声处理30s,间歇30s,工作12个循环。12000rpm,30min低温高速离心,取上清用His-Tag purify -cation kit亲和层析纯化,将纯化的融合蛋白缓冲液进行透析后,用肠激酶切割。SDS-PAGE电泳结果表明表达产物可溶性达70%以上。抗菌活性试验表明表达产物对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有抑菌作用。对革兰氏阴性菌作用比革兰氏阳性菌明显。 本研究为抗菌肽的生产提供了一条重要的途径,并为进一步研究抗菌肽的生产表达、结构与功能、抗菌的特性、改造已有的抗菌肽、设计新型的抗菌肽药物奠定了基础。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q78

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【参考文献】
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