外源脱水应答转录因子DREB1B和CBF1基因在转基因小麦中表达研究
【摘要】：干旱是严重影响作物生长和产量的主要环境限制因素之一。在干旱胁迫下,植物表达的基因分为两类:1.基因编码的产物为一些功能蛋白和酶类,如LEA,水通道蛋白,脯氨酸合成酶等;2.基因编码的产物为传递信号和调控基因表达的转录因子,如bZIP,MYC,DREB等。对于第二类基因,鉴于这些基因的表达调控其下游一系列功能基因,目前已成为抗旱基因工程的重点。DREB(Dehydration Responsive Element Binding)和CBF1(CRT/DRE binding factor 1)是拟南芥菜中发现的一个顺式调控元件,在逆境胁迫下,DREB和CBF1转录因子可激活其它多达12个依赖DRE顺式作用元件的抗逆功能基因,如RD29、COR15、RD17,从而使植株多方面的抗逆性(抗旱、抗冻及抗盐)得到提高,因此克隆DREB1B和CBF1基因,并转化到小麦品种中,以提高小麦的对干旱胁迫的抗性。
本实验以冬小麦8901,5-98,99—92和保丰104品种为受体品种,以基因枪微弹轰击转化携带有目的基因DREB1B和CBF1基因的逆境诱导表达类型质粒pBPC128F和pBPC127F载体获得的转基因再生植株79株为材料,经除草剂Basta(100mg/L)抗性鉴定T_1代,部分转基因株系表现出明显的抗性。
转外源转录因子DREB1B基因株系采用点杂交与PCR结合的方法对转基因小麦T_0和T_1代快速进行DNA水平的分子鉴定,同时作了RNA的分子检测,结果表明所选转基因植株中外源基因能够正常转录。
对经过检测的转DREB1B基因株系采用与抗旱性密切相关的相对含水量,叶绿素含量,脯氨酸含量,光合速率四个生理指标进行测定,有10个株系在四个生理指标上相比对照都有明显提高,其中相对含水量均在15%以上,明显高于CK(7.19～9.13%);叶绿素含量中,叶绿素a含量均在0.07μg/ml以上,叶绿素b含量在0.14μg/ml以上,高于CK的叶绿素a(0.02～0.05μg/ml)和叶绿素b(0.5～0.9μg/ml);脯氨酸含量在1000μg/g以上,是对照(222.1～604.44μg/g)的2倍多;光合速率均在8.0μmol CO_2/m~2/s以上,高于CK(2.27～2.47μmol CO_2/m~2/s)。
室内抗旱模拟试验表明,转基因株系停止浇水15天后,叶片仍然表现绿色,而对照叶片则失绿、枯干;复水10天后,转基因株系恢复活力,对照则死亡。
转外源转录因子CBF1基因株系选用地高辛标记的CBF1和bar基因作为探针,进行点杂交检测。结果表明,无论是用CBF1探针,还是bar基因探针,证明了外源基因已整和
【关键词】：小麦 转基因 DREB1B基因 CBF1基因 生理指标 抗旱性 【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2005
【分类号】：S512.1
【目录】：
- 第一章 文献综述11-52
- 1.1 植物对非生物胁迫的反应11-42
- 1.1.1 植物对非生物胁迫的反应表现12
- 1.1.2 非生物胁迫下的逆境蛋白和逆境基因12-21
- 1.1.2.1 热激蛋白及基因13-15
- 1.1.2.2 抗冻基因15-17
- 1.1.2.3 调渗蛋白及基因17-19
- 1.1.2.4 缺氧和低氧胁迫蛋白ANPs(Anaerobic Proteins)19-21
- 1.1.3 逆境诱导的启动子21-23
- 1.1.3.1 hsp启动子21-22
- 1.1.3.2 rd29启动子22
- 1.1.3.3 adh1启动子22
- 1.1.3.4 ABRE22-23
- 1.1.3.5 LTRE23
- 1.1.4 逆境下的转录因子23-31
- 1.1.4.1 转录因子的结构与功能23-27
- 1.1.4.2 四大类转录因子27-31
- 1.1.5 逆境下的信号转导成份31-42
- 1.1.5.1 乙烯受体与乙烯信号转导31-33
- 1.1.5.2 G-蛋白33-35
- 1.1.5.3 MAPK信号级联及其功能35-38
- 1.1.5.4 Ca~(2+)-CaM38-40
- 1.1.5.5 ABA40-42
- 1.2 抗逆基因工程42-47
- 1.2.1 抗冷、抗冻基因工程42-44
- 1.2.1.1 转抗冷、抗冻基因42-43
- 1.2.1.2 转与低温相关酶基因43-44
- 1.2.2 植物抗旱基因工程的研究进展44-46
- 1.2.2.1 转渗透性代谢产物的合成酶基因44-45
- 1.2.2.2 转抗旱基因及转录因子基因工程45-46
- 1.2.3 转耐盐基因植物46-47
- 1.2.3.1 转渗透调节和耐盐基因植物46-47
- 1.2.3.2 转录因子基因植物47
- 1.2.4 抗涝基因工程47
- 1.3 DREB和CBF转录因子及其在植物抗逆中的作用47-52
- 1.3.1 转录因子与抗逆性47-50
- 1.3.1.1 AP2／EREBP转录因子家族47-48
- 1.3.1.2 DREB和CBF1转录因子48-50
- 1.3.2 植物中的转录因子与抗逆性50-52
- 第二章 前期研究52-64
- 2.1 DREB1B和CBF1基因的克隆与表达载体的构建53-60
- 2.1.1 材料与方法53-54
- 2.1.1.1 植物材料53
- 2.1.1.2 方法53-54
- 2.1.2 结果与分析54-60
- 2.1.2.1 RD29B启动子的克隆和序列分析54-56
- 2.1.2.2 DREB1B基因的克隆和序列分析56-57
- 2.1.2.3 CBF1基因的克隆和序列分析57-58
- 2.1.2.4 表达载体的构建58-60
- 2.2 DREB1B和CBF1基因的转化60-62
- 2.2.1 材料和方法60-61
- 2.2.1.1 材料60
- 2.2.1.2 基因枪转化60-61
- 2.2.2 结果和分析61-62
- 2.2.2.1 PDS1000／He基因枪转化61
- 2.2.2.2 转基因苗的移栽61-62
- 2.3 本研究的目的和意义62-64
- 第三章 转基因植株后代除草剂抗性鉴定64-67
- 3.1 材料和方法64
- 3.1.1 材料64
- 3.1.2 方法64
- 3.2 结果和分析64-65
- 3.2.1 转基因植株后代除草剂抗性鉴定64-65
- 3.3 讨论65-67
- 第四章 转基因植株的分子生物学鉴定67-75
- 4.1 材料与方法68-69
- 4.1.1 材料68
- 4.1.2 方法68-69
- 4.1.2.1 转基因植株的PCR检测68
- 4.1.2.2 转基因植株的点杂交分析68
- 4.1.2.3 RNA的分子杂交鉴定68
- 4.1.2.4 SDS-PAGE蛋白电泳68-69
- 4.2 结果与分析69-72
- 4.2.1 DREB1B转基因植株的分子生物学检测69-71
- 4.2.1.1 T_0代转基因植株的PCR检测69
- 4.2.1.2 T_1代转基因植株的点杂交和PCR结果69-70
- 4.2.1.3 转基因植株后代的RNA分子杂交检测70
- 4.2.1.4 转基因植株的SDS-PAGE蛋白电泳70-71
- 4.2.2 CBF1转基因植株的分子生物学检测71-72
- 4.2.2.1 T_1代转基因植株的点杂交结果71
- 4.2.2.1 T_1代转基因植株的PCR结果71-72
- 4.3 讨论72-75
- 第五章 转基因小麦抗旱相关生理指标的测定及抗旱性鉴定75-82
- 5.1 材料与方法75-77
- 5.1.1 材料75
- 5.1.2 转基因小麦(干旱处理)的相关生理指标的测定75-77
- 5.2 结果与分析77-80
- 5.2.1 相对水含量的测定结果77
- 5.2.2 叶绿素含量的测定结果77-78
- 5.2.3 脯氨酸含量的测定结果78-79
- 5.2.4 光合速率的测定结果79-80
- 5.2.5 转基因植株的抗旱效果鉴定80
- 5.3 讨论80-82
- 第六章 结论82-84
- 参考文献84-98
- 致谢98-99
- 作者简介99
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