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《西北农林科技大学》 2005年
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人类胚胎生殖细胞的分离克隆及生物学特性研究

华进联  
【摘要】:原始生殖细胞(PGCs)是各级生殖细胞和成熟配子的共同祖先。在体外适宜的培养条件下,PGCs 大量增殖形成与ESCs 高度类似的多能性细胞,称作EG 细胞。目前,小鼠和其他哺乳动物及人类:EG 细胞的分离培养均取得一些重要的进展,但有关人类PGCs 发育分化、体外分离培养体系及影响因素、无血清培养及检测、人类EGCs 的诱导分化特性等尚未见到系统的研究报道,本研究对上述4 个方面展开研究,以期探索出人类胚胎性腺生殖细胞发育分化规律;建立优化的人类EGCs 无血清分离培养体系;检测人类EGCs 的多向分化潜能,并在人类:EGCs 分离培养的基础上,向hEGCs 转染人类心肌α-actin 启动子,以探索人类心肌α-actin 启动子在人类心肌细胞分化中的作用。 1 人胚胎性腺生殖细胞发育分化的研究 组织学观察人胚胎睾丸和卵巢,Ki67 在10 w 胚胎睾丸表达最强,卵巢则在20 w 强表达。Bcl-2 在11.5 w 胚胎睾丸强表达,而在胚胎卵巢发育中一直表达较弱。在5~12 w 的睾丸,PGCs 强表达AKP、Oct4、SSEA-1;13 w 后,随胎龄增大,Oct4、AKP、SSEAl 表达减少。在5~32 w 的卵巢内,Oct4、AKP、SSEAl 在8 w 内的生殖细胞强表达;但在14 w 以后卵巢,Oct4、AKP、SSEAl 表达逐渐减少。透射电镜观察,早期胚胎的生殖嵴/腺见到大量的PGCs,一般为圆形或椭圆形,细胞核大,核质比高,细胞器较少。在出现性别分化后,雄性可见有间质细胞和支持细胞,细胞器较为丰富。雌性可见较大的卵母细胞和颗粒细胞。 2 人类胚胎生殖细胞分离克隆体系的建立 5%~15%NBS 均可以满足HEF、MEF 生长,以8%~10%NBS 为宜。对H=EF 的培养, 以}tDMEM 和α-MEM 效果较好。对MEF 的培养,HDMEM 效果最好。MEF、STO、HEF 等制作好的饲养层细胞维持时间不能超过7 d , 一般为5 ~7 d 。 研究了流产胎儿对hEGCs 分离克隆的影响,表明7~12 w 最适于hEGCs 分离克隆, 自雄性胎儿分离hEGCs 的成功率明显高于雌性。 筛选了几种细胞因子对hEGCs 生长增殖的最佳剂量,表明RA 和Forskolin 的最佳剂量分别为10-6mol/L 和10 u mol/L;LIF 为5 ng/mL:bFGF 为10 ng/mL;TNFa 为25 ng/mL;TGFB 的添加不利于hEGCs 克隆增殖;进一步将各种细胞因子组合能提高hPGCs 克隆增殖率,以此提出hEGCs 的最优培养基为:HDMEM+15%KSR+0.1 mmol/L 2Me +O.1 mmol/L 非必需氨基酸+2 mmol/L 谷氨酰胺+100 u/mL 青霉素+100 u/mL 链霉素,
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:Q813

【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 董武子;牛雄性生殖干细胞分离培养特性及移植研究[D];西北农林科技大学;2006年
2 王晗;人源羊水干细胞分离培养、生物学特性检测及诱导分化研究[D];西北农林科技大学;2008年
【共引文献】
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2 王世锋;王文波;;不同剂量高分压氧暴露对小鼠肺组织巨噬细胞炎症蛋白-2表达的影响[A];中国活性氧生物学效应学术会议论文集(第一册)[C];2011年
3 张丽瑞;李旭;陈葳;;人胚胎干细胞建系的方法学研究进展[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
4 成钢;冯书堂;牟玉莲;;五指山猪近交系精原干细胞体外分离、培养实验研究[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
5 李玉巍;刘蕾;;鸡马立克氏病中细胞凋亡与细胞增殖的原位观察[A];吉林省畜牧兽医学会2007学术年会论文集[C];2007年
6 安立龙;效梅;张土保;董喜芳;许英梅;;不同浓度犊牛血清对三黄鸡原始生殖细胞生长、增殖的影响[A];中国畜牧兽医学会家畜生态学分会第七届全国代表大会暨学术研讨会论文集[C];2008年
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1 高琦;急性脊髓缺血/再灌注损伤能量代谢相关蛋白质组与代谢组学初步分析[D];吉林大学;2011年
2 周岚;补气活血法防治失神经肌萎缩的机理研究[D];南京中医药大学;2011年
3 辛晓玲;特定转录因子诱导新生牛成纤维细胞为多能性干细胞的研究[D];西北农林科技大学;2011年
4 胡楠;自体骨髓基质细胞组织工程化神经修复猕猴正中神经50mm缺损的实验研究[D];苏州大学;2011年
5 唐志鹏;健中愈疡片改善胃溃疡愈合质量及其作用机理研究[D];广州中医药大学;2000年
6 万兴旺;抑癌基因PTEN在人原发性肝细胞性肝癌中的表达、突变及其生物学意义[D];第二军医大学;2001年
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8 李相运;小鼠胚胎干细胞多能性研究[D];西北农林科技大学;2001年
9 秦瑞峰;MyoD诱导成纤维细胞分化为肌细胞及肌肉重建的实验研究[D];第四军医大学;2002年
10 邓志宽;钙蛋白酶在缺血性脑损伤中的作用和FNS对其活性的调节及其机制的研究[D];重庆医科大学;2002年
【同被引文献】
中国博士学位论文全文数据库 前4条
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2 刘永刚;人EG细胞分离、培养及其定向诱导为造血细胞的实验研究[D];重庆医科大学;2005年
3 安立龙;牛胚胎干细胞的分离与克隆[D];西北农业大学;1999年
4 杨炜峰;山羊胚胎干细胞和胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定[D];西北农林科技大学;2006年
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2 徐小明;华进联;葛秀国;窦忠英;;牛胚胎生殖细胞的分离与培养[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
3 华进联;徐小明;杨玉艾;刘雨潇;李松;雷安民;窦忠英;;人类胚胎生殖细胞分化为心脏跳动样细胞团的研究(英文)[A];全国首届动物生物技术学术研讨会论文集[C];2004年
4 李方华;李林凤;庞全海;关伟军;马月辉;;北京鸭胚胎生殖细胞的分离培养及诱导分化的研究[A];中国动物遗传育种研究进展——第十五次全国动物遗传育种学术讨论会论文集[C];2009年
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5 葛秀国;山羊胚胎干细胞的分离与培养[D];西北农林科技大学;2007年
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