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利用分子标记技术分析鉴定杂交油菜种子纯度研究

穆建新  
【摘要】:油菜是我国的主要油料作物之一,利用油菜的杂种优势是提高产量和改良品质的重要途径,我国杂交油菜播种面积已占总播种面积的50%以上。杂交种能否发挥其杂种优势关键是种子纯度,杂交油菜中的主要杂株类型是不育系株和恢复系株,所以,杂交油菜种子纯度的鉴定即是杂交种与其父母本的鉴别。 本实验应用RAPD和SSR分子标记技术,以甘蓝型油菜细胞质雄性不育杂交种秦优7号及其亲本不育系陕3A、恢复系K407为材料,对杂交油菜种子纯度鉴定技术进行了比较研究,获得了以下主要结果: 1.通过对814个RAPD随机引物和100对SSR引物的筛选,获得2个RAPD引物(S_(93)和S_(469))和1对SSR引物(S_A82),能将秦优7号杂交种及其父母本同时区分开来;杂交种带型表现为父母本的互补带型,区别明显,显带清晰稳定。 2.建立了油菜微量DNA快速提取技术,用发芽3—5d的幼芽,在样品研磨前加入氯仿,使蛋白变性和大多数酶失活或钝化,防止DNA降解;省去了“抽提”和“清洗”等步骤,使提取大大简化;同时还缩短了水浴、冰浴和离心时间,加快了提取速度,提高了提取效率。 3.通过反应体系的优化,建立了适宜于杂交油菜种子纯度鉴定的RAPD和SSR反应体系。RAPD和SSR扩增体系为:20μL反应体积中,10×buffer[含(NH_4)_2SO_4]2.0μL,Mg~(2+)浓度2.0mmol/L,dNTP浓度0.2mmol/L,1U的Taq DNA聚合酶,模板DNA30-40ng,RAPD随机引物浓度0.25μmol/L,SSR左、右引物各2.5ng/μL。SSR反应程序选用了梯度递减的退火温度,提高扩增结果稳定性。 4.与酯酶同工酶法比较,RAPD和SSR技术能够将酯酶同功酶法难以鉴别的杂交种秦优7号及其亲本恢复系明显区分开来。SSR与RAPD标记比较,SSR具有稳定性好和带型简单易于鉴别的特点,在杂交油菜种子纯度鉴定中有着广阔的应用前景。 5.RAPD和SSR分子标记技术,在筛选合适引物的基础上,按照快速法提取DNA,建立标准化的检测体系,重复使用琼脂糖凝胶,降低检测成本,完全可以使这项技术在杂交油菜种子纯度检测中实用化。


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