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《西北农林科技大学》 2006年
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昆白小鼠胚胎干细胞的分离、培养及鉴定

李三华  
【摘要】: 昆白小鼠是我国最常用的实验动物之一,但已经建立的小鼠ES细胞系大多来源于129、C57BL/6J和BALB/C品系的小鼠,而用昆白小鼠建系的报道很少。因此建立昆白小鼠细胞ES系对我国深入而便利地开展干细胞的研究具有重要意义。本研究从昆白小鼠胚胎中分离克隆出小鼠ES细胞,并对其进行了传代培养和鉴定,对影响小鼠ES细胞分离克隆的一些因素进行了探讨,目的在于筛选出更适合昆白小鼠ES细胞的分离克隆体系,为进一步建立昆白小鼠ES细胞系奠定基础,实验主要结果如下: 1.从446枚昆白小鼠胚胎中分离培养ES细胞,323枚ICM长出,ICM形成率为72.4%;并从72枚ICM中得到ES细胞,ES细胞的形成率为16.1%,最高所传代数为5代。 2.比较了不同的饲养层对昆白小鼠ES细胞分离克隆的影响:分别以MEF、STO、经丝裂霉素C处理后冷冻再解冻的STO和PEF作为饲养层;在这4种饲养层上,胚胎的孵化率和ICM形成率差异不显著;但在原代集落形成率和传代次数上差异显著(p0.05):MEF的效果最好,STO、经丝裂霉素C处理后冷冻再解冻的STO次之,PEF最差。 3.利用BRL-CM作为培养液培养昆白小鼠的胚胎和ES细胞,胚胎可正常贴壁,ICM也可正常长出;将ICM分离接种有饲养层和无饲养层的条件中,只有条件培养基BRL-CM和饲养层相互结合时,才能促进昆白小鼠的ES细胞增殖并维持早期传代而保持不分化状态,这说明昆白小鼠ES细胞分离培养过程中,BRL-CM还不能完全替代饲养层的作用。 4.比较了不同的传代方法对昆白小鼠ES细胞分离克隆的影响:分别用0.25%的Trypsin-EDTA和2.4U/mL的Diapase作为消化液以酶消化法,用0.10%的Trypsin-EDTA和2.4U/mL的Diapase作为消化液以酶消化法+机械剥离来传代ES细胞;0.25%的Trypsin-EDTA对细胞的损伤较大,不适合昆白ES细胞的传代,其他3种方法均适合昆白ES细胞的传代。 5.对分离得到的ES细胞进行了AKP活性和体外分化能力鉴定,核型分析:AKP染色阳性,体外可自发分化成神经样细胞,将ES细胞离散成单细胞后,用不加LIF的培养液进行悬滴培养,得到了类胚体,说明所得到的ES细胞具有胚胎干细胞的典型特征;对其中的一株ES细胞核性分析,其核型为正常的XX型二倍体。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q813

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