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《西北农林科技大学》 2006年
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猪瘟病毒E2基因在PK-15细胞中的表达及本体动物的免疫研究

刘建玲  
【摘要】: 猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的急性高度接触性传染病,是严重威胁养猪业,具有重要经济意义的病毒性疾病之一。猪瘟病毒可引起猪小血管和毛细血管内皮细胞发生变性、坏死,表现为全身组织器官弥漫性出血。猪瘟病毒为黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员,基因组大小约12.3kb,含一个大的开放阅读框(ORF),由11个编码结构蛋白与非结构蛋白的基因组成。 猪瘟病毒E2基因编码的gp55蛋白是猪瘟病毒的主要保护性抗原,是研制猪瘟基因工程疫苗的首选基因。采用来源于猪的PK–15细胞做为表达系统,一方面可利用猪细胞对猪瘟病毒遗传密码子的嗜好性,提高E2蛋白的表达量,另一方面猪源细胞表达的E2蛋白的加工与其他表达系统相比有无比的优越性,其免疫原性和疫苗的免疫保护力可望得到很大提高,为猪瘟病毒基因工程疫苗投入实际应用奠定基础。 本研究由三部分构成,第一部分是采用反转录PCR(RT-PCR)和套式PCR(nPCR)克隆出猪瘟病毒石门株的E2基因,并对其核苷酸序列及氨基酸序列的同源性进行比较及分析,绘制系统关系发生树,以期了解猪瘟病毒石门株经多次传代后E2基因的遗传变异情况,为用其研制猪瘟基因工程疫苗提供毒株分子生物学方面的资料。第二部分是用逆转录病毒载体将猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因整合到PK-15细胞基因组中,在PK-15细胞的细胞膜上表达猪瘟病毒E2基因囊膜蛋白。第三部分用表达囊膜蛋白的PK-15细胞免疫Balb/c小鼠和猪,检测抗体水平,并对免疫接种猪进行攻毒试验,为猪瘟基因工程疫苗的应用奠定基础。 1.采用RT-PCR和nPCR扩增出猪瘟病毒石门株E2基因,将其分别克隆于pGEM-T Easy载体并进行核苷酸序列测定,进行了核苷酸及氨基酸序列同源性比较,绘制了系统关系树。结果表明,所测CSFV石门株E2基因的长度为1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列,共由384个氨基酸组成。将石门株与C株疫苗毒E2基因的核苷酸和所推导的氨基酸序列进行比较,表明其核苷酸序列同源性为94.5%,所推导的氨基酸序列同源性为93. 8%,说明石门株与C株疫苗毒之间存在一定的差异。 2.将猪瘟病毒石门株E2基因插入逆转录病毒载体pBABE-puro中构建成重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2,该重组逆转录病毒载体与pVSVg质粒经磷酸钙共转染,将其转入293GP细胞中包装逆转录病毒假病毒。用包装的假病毒感染PK-15细胞,经嘌呤霉素筛选阳性细胞后进行流式细胞技术(FACS)分析和免疫荧光染色鉴定,结果表明猪瘟病毒E2基因在PK-15细胞膜上成功表达。 3.将表达E2蛋白的PK-15细胞作为基因工程细胞苗腹腔免疫Balb/c小鼠,经FACS
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:S852.65;S852.5

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【共引文献】
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4 蒋再学;陈征兵;林文;余邵华;竺薇;张晓明;罗满林;;仔猪伪狂犬PCR鉴定及病毒分离[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第三次学术研讨会论文集[C];2012年
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8 赵东升;盖新娜;孙栋;郭鑫;杨汉春;;猪脑心肌炎灭活疫苗的制备及小鼠免疫研究[A];微生物与人类健康科技论坛论文汇编[C];2009年
9 徐波;张莉;李启云;王景会;姜媛媛;杨贞耐;;牛凝乳酶成熟肽基因在大肠杆菌中的表达[A];中国奶业协会年会论文集2008(下册)[C];2008年
10 刘冬光;廖娟红;于清龙;陈颖钰;陈焕春;郭爱珍;;融合蛋白Rv3872/CFP-10/ESAT-6的制备及在牛结核诊断中的初步应用[A];中国奶业协会年会论文集2009(上册)[C];2009年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 赵冬敏;B亚群禽白血病病毒分离株的生物学特性[D];山东农业大学;2010年
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4 张青婵;A亚群禽白血病病毒不同分离株的基因组和生物学特性比较[D];山东农业大学;2010年
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9 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
10 生书晶;何首乌芪合酶基因(FmSTS)的克隆、鉴定及转化拟南芥研究[D];华南理工大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 高红梅;ETEC对断奶腹泻仔猪胃肠道紧密连接蛋白ZO-1的影响[D];华中农业大学;2010年
2 许媛媛;鸭瘟的动态病理学研究和鸭CD4的克隆[D];华中农业大学;2010年
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4 汪艳杰;水稻polycomb基因家族甲基化状态初步检测[D];华中农业大学;2010年
5 王伟;恶臭假单胞菌表面展示细菌漆酶及对染料的脱色性能[D];华中农业大学;2010年
6 李爽;鸭源禽呼肠孤病毒感染雏鸭的免疫病理学研究[D];华中农业大学;2010年
7 黄辉;哈维弧菌表面抗原的克隆和真核表达[D];华中农业大学;2010年
8 段龙川;产毒素多杀性巴氏杆菌重组沙门氏菌基因工程疫苗的研究[D];华中农业大学;2010年
9 龚瑞;粘附素ClfA和Cna对金黄色葡萄球菌乳腺炎的免疫保护研究[D];华中农业大学;2010年
10 徐珊珊;重组杆状病毒介导的高致病性猪繁殖与呼吸综合征基因工程疫苗研究[D];华中农业大学;2010年
【同被引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 金扩世,涂长春,殷震;猪瘟病毒保护性囊膜糖蛋白E1基因的研究进展[J];病毒学报;1996年03期
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7 吕宗吉,涂长春,余兴龙;猪瘟病毒基因组结构与功能的研究进展[J];广东畜牧兽医科技;2001年04期
8 高彦生,兰乃洪;2002年6月国际动物疫情[J];中国畜牧兽医;2002年04期
9 罗廷荣;猪瘟病毒生物学特性研究的一些新进展[J];广西农业生物科学;2001年01期
10 黄茜华,张楚瑜;猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析[J];湖北农学院学报;1999年01期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 洪海霞;永生化猪脐静脉血管内皮细胞系的建立及其生物学特征分析[D];西北农林科技大学;2007年
【二级引证文献】
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1 毛燕;广西猪瘟病毒分子流行病学调查及单克隆抗体的制备[D];广西大学;2012年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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【相似文献】
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2 王青;胡建和;郑素玲;吴玉苹;;猪瘟病毒E2基因活载体疫苗研究进展[J];动物医学进展;2010年07期
3 李明晖,刘湘涛,韩雪清,侯文通,赵启祖,马军武,刘伯华,刘在新,李健强,李忠润,谢庆阁;4株猪瘟流行野毒株病毒结构蛋白E2基因的核苷酸序列分析[J];中国兽医科技;2001年05期
4 刘建玲;苏正元;许信刚;李谱华;张彦明;;猪瘟病毒Shimen株E2基因的克隆及其逆转录病毒表达载体的构建[J];中国兽医学报;2006年03期
5 刘伯华,刘湘涛,韩雪清,赵启祖,李明晖,谢庆阁;急、慢性猪瘟病毒分离株和疫苗株E2基因的序列分析[J];畜牧兽医学报;2001年06期
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中国重要报纸全文数据库 前10条
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5 张建刚;当前猪瘟流行的新特性[N];中国畜牧报;2003年
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7 蔡涛 关景火 李德华;塑造“面子”[N];计算机世界;2002年
8 袁华;猪夏季高热性疾病的防治[N];江苏农业科技报;2010年
9 瑞普(天津)生物药业有限公司 李刚 谢雪松;控制商品子猪综合征有效办法初探[N];中国畜牧兽医报;2009年
10 季作善 曹同德 李连任;我国猪瘟流行现状与防治对策[N];中国畜牧报;2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
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6 季新成;猪瘟病毒E2基因的克隆及其在昆虫细胞中的表达[D];西北农林科技大学;2004年
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9 张玉德;我国西北三省近年猪瘟分子流行病学分析[D];甘肃农业大学;2006年
10 胡慧;猪瘟病毒E2基因的表达及其间接ELISA诊断方法的研究[D];西北农林科技大学;2004年
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