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《西北农林科技大学》 2006年
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猪脂肪间充质干细胞的分离培养及体外诱导分化研究

屈长青  
【摘要】: 在动物体内,脂肪组织不仅是重要的能量贮存库和赋形组织,还是保持内环境稳定及具有分泌激素和细胞因子的重要部位。脂肪细胞增殖与分化失常是导致肥胖及Ⅱ型糖尿病的重要因素。因此,脂肪细胞分化的研究一直是国内外医学及生物学领域的研究热点之一。2001年Zuk等发现脂肪中存在脂肪间充质干细胞(adipose mesenchymal stem cells, AMSCs)以来,在人、小鼠、大鼠和兔等多个物种上的研究证明其具有体外分化为多种细胞表型的能力。脂肪组织与骨髓相比,具有易分离,干细胞含量高等优点,在体外培养条件下,AMSCs要比骨髓MSCs具有更高的增殖速率,因此其有望成为未来细胞/基因治疗和组织工程的主要种子细胞之一。猪沉积脂肪能力强,是研究脂肪组织形成与发育较为理想的动物模型。近年来的研究也证明,猪在遗传上比通常使用的其他实验动物如小鼠和大鼠等更接近人类。但是,迄今为止,国内外尚未见关于猪AMSCs分离、培养和多向分化等方面的系统研究报道。 本文以1-3日龄仔猪为实验动物,采集颈部及肩胛部皮下脂肪组织,胶原酶消化法获得AMSCs,传代培养,利用免疫组化、流式细胞仪和扫描电镜分析等实验技术研究了猪AMSCs的基本特性;运用免疫组化和RT-PCR法研究了AMSCs在不同因子诱导作用下向成骨细胞、成肌细胞及脂肪细胞分化能力。在此基础上,对比研究了AMSCs成脂诱导与原代培养的基质微管(sromal vascular fraction,SVF)细胞增殖与分化模式,为利用AMSCs研究脂肪细胞形成与分化早期事件奠定了基础。主要结果如下: 1.应用胶原酶消化法分离获得猪脂肪基质微管成份(Stromal vascular fraction,SVF),进行原代培养,其中的AMSCs可形成集落。已传21代,并已扩增到1.0×108个细胞。 2.本实验所分离的猪AMSCs呈三角形或长梭形,易形成集落,类似于从人和其他物种所分离获得的AMSCs。 3.扫描电镜下,猪AMSCs表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突。 4.免疫细胞化学与流式细胞仪检测分析表明,猪AMSCs能够表达间充质干细胞的表面标志CD44和CD105(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34和CD106 (阴性),也不表达成纤维细胞表面标记HLA-DR和前体脂肪细胞与脂肪细胞特异表面标记S-100。 5.在体外可诱导猪AMSCs分化为成骨细胞。诱导后,碱性磷酸酶活性提高而呈现阳性反应,产生茜素红染色阳性的矿化结节。RT-PCR在诱导第7天检测到成骨特异基因骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原(COL-Ⅰ)的表达,随诱导时间的延长,两者mRNA水平均呈上升趋势。
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