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《西北农林科技大学》 2006年
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胎猪骨髓间充质干细胞核移植及核移植胚胎干细胞的分离

徐小明  
【摘要】: 本研究以猪不同类型的细胞为供核细胞,体外成熟去核卵母细胞为受体胞质在体外构建胚胎,建立了体外生产体细胞核移植胚胎的技术体系,为体细胞克隆猪及核移植源胚胎干细胞(ntESCs)系的分离提供良好的平台。论文主要从以下5个方面进行了研究: 1.供核细胞的准备 共从4例胎儿肌肉组织中分离得到4个猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, pFF)株,从1例新生猪耳组织中用组织块培养法分离得到一个耳部皮肤成纤维细胞(porcine ear skin fibroblasts, pESF)株,从3例胎猪骨髓中分离得到3个胎猪骨髓间充质干细胞(porcine fetal mesenchymal stem cells, pFMSCs)株。将1~5代的pFF、pESF及pFMSCs分别进行冷冻保存,解冻复苏后形态及活力没有明显变化。pFMSCs形态为成纤维样,呈长梭形,连续传13代后形态没有明显改变。传代培养的pFMSCs生长潜伏期为1~2 d ,之后进入对数增殖期,接种后的第6天进入平台期。透射电镜分析表明,pFMSCs细胞核质比高,胞浆中细胞器少。核型分析表明,pFMSCs具有正常的核型(2n=38,XY)。流式细胞仪检测显示,pFMSCs表达细胞表面抗原CD44,CD166,CD105,CD117,不表达CD45,CD90,CD11a,CD14。在β-巯基乙醇作用下,pFMSCs可诱导分化为神经样细胞,Nestin染色阳性。经血清饥饿和接触抑制处理的pFMSCs,流式细胞仪检测G0/G1期的细胞分别为86.72%和88.44%。以上细胞的分离培养为猪体细胞核移植相关研究打下了基础。 2.猪卵母细胞体外成熟培养体系的建立 从屠宰场采集猪卵巢,选择颗粒细胞层数2层以上、胞质均一的COCs进行体外成熟培养,对培养液组份进行了比较发现:①mM199组猪卵母细胞成熟率显著高于M199组(71.7% vs 59.7%)(p0.05),mM199组和M199组较NCSU-23组(43.6%)均能显著提高卵母细胞的成熟率(p0.01)。②PMSG+hCG+FSH组卵母细胞成熟率略高于FSH+LH组,二组卵母细胞成熟率显著高于hMG组(p0.01)。③分别添加FBS和PFF与对照组(分别不添加FBS和PFF)成熟率无统计学上的差异,但电激活后,均能显著提高卵裂率(p0.05),桑囊率二者无显著差异(p0.05)。④单独添加EGF和联合添加EGF和ITS卵母细胞成熟率较不添加组稍有提高。电激活后,均能显著提高桑囊率(p0.05)。⑤选择颗粒细胞层数3层以上的COCs可以显著提高卵母细胞体外成熟率
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q813

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【引证文献】
中国博士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国博士学位论文全文数据库 前5条
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