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苯巴比妥残留免疫学快速检测技术研究

王自良  
【摘要】: 苯巴比妥(Phenobarbital,PB)具有镇静、催眠、麻醉、抗惊厥、抗癫痫等药效作用,临床上主要用于治疗焦虑、失眠、癫痫发作、高胆红素血症等疾病。由于PB的镇静、催眠特殊生物学作用,常被用作饲料添加剂。但PB对人体具有致畸、致癌等毒性作用,世界各国均规定食品动物生产中不得使用PB,动物性食品中不得检出PB。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便等优点在药物残留检测领域已被广泛应用,替代了理化检验方法,美国和德国已研制出PB残留免疫学检测产品,国内尚属空白。本研究对PB的免疫原性、人工抗原合成、多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb)制备及其特性、试剂盒研制及其性能、免疫金标试纸研制及其性能、气-质联用(GC-MS)对试剂盒和免疫金标试纸的确证等进行了研究。 在分析PB分子结构和免疫原性基础上,将PB经过硝化和还原两步化学修饰在其苯环上引入活性基团氨基,合成具有半抗原结构特征的对氨基苯巴比妥(pAPB),用重氮化法将pAPB偶联于牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA),合成人工免疫原BSA-pAPB和包被抗原OVA-pAPB,通过红外(IR)、紫外(UV)、SDS-PAGE和免疫小鼠后抗血清的ELISA鉴定,BSA-pAPB偶联成功,分子结合比为1∶19,获得了高价、敏感、特异的抗血清。 用BSA-pAPB免疫新西兰白兔5只,8次免疫后获得了PB pAb,经鉴定,其间接ELISA效价为1∶6.4×10~5,阻断ELISA测定半数抑制浓度(IC50)为14.8μg/L,与巴比妥的交叉反应率(CR%)为9.7%,与其它化合物无CR,琼脂双扩散实验结果表明产生了针对pAPB的特异性抗体,WestGold实验结果表明与PB特异性结合。用BSA-pAPB免疫Balb/C小鼠5只,5次免疫后用间接ELISA和阻断ELISA选择出细胞融合备用小鼠1只,应用细胞融合技术筛选出1B9、3C4、3F6、4E6共4株敏感特异的杂交瘤细胞,用体内诱生腹水法制备PB mAb,经鉴定,其间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶2.7×10~2、1∶5.12×10~2、1∶3.2×10~2、1∶8.1×10~2,腹水分别为1∶2.56×10~5、1∶5.12×10~4、1∶3.2×10~5、1∶6.4×10~5,同种型分别为IgG_(2a)/κ、IgG_(2a)/λ、IgG_1/κ、IgG_1/κ,亲和常数(Ka)分别为2.55×10~9、1.03×10~(10)、3.76×10~9、2.08×1010(L/mol),其中亲和力最高的4E6株阻断ELISA测定其IC_(50)为11.35μg/L,与巴比妥的CR%为8.4%,与其他化合物无CR,WestGold实验结果表明与PB特异性结合。本实验制备的PB pAb和PB mAb均可用于PB残留检测的免疫学试验,PB mAb更好。应用PB mAb研制出PB残留快速检测阻断ELISA和竞争ELISA试剂盒(PB-Kit),其中竞争ELISA试剂盒的质量性能更好,PB-Kit的标准曲线呈S型,符合4参数logit


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