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《西北农林科技大学》 2006年
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山羊皮肤干细胞及绿色荧光蛋白基因转染研究

刘大勇  
【摘要】: 表皮干细胞在创伤愈合过程中扮演着重要角色,目前利用表皮干细胞进行组织重建和转基因研究成为生物医学领域的重要方向。绿色荧光蛋白(GFP)是细胞生物学研究中应用最广泛的标记性蛋白质之一,不用加外源底物就能在活细胞中直接观察基因是否表达。本试验从山羊皮肤干细胞分离培养、生物学性特性鉴定、可塑性及GFP基因转染四个方面进行研究,为皮肤干细胞的临床应用提供基础资料。1.山羊皮肤干细胞的分离培养 组织块培养法:浸洗、抗菌处理后,将皮肤切成0.1 cm×0.1cm左右的小块,表皮面朝上贴于铺有0.1%明胶的培养皿中,加少量培养液浸润, 2 h后用HDMEM/F12(3:1)+20%血清+5μg/mL胰岛素+0.5μg/mL氢化可的松+100单位双抗培养液培养,3日换液一次。有细胞脱出后把血清体积分数换为10%进行培养。 DispaseII酶消化法:浸洗、抗菌处理后将皮肤块切割成0.5 cm×1 cm左右的条状,在含4 mg/mL DispaseII酶的小瓶中4 0C冷消化16 h。分离表皮与真皮,将表皮剪成糜状,0.25%胰酶37℃消化5-7 min后中和,过滤,离心,接种。用HDMEM/F12(3:1)+10%血清+5μg/mL胰岛素+0.5μg/mL氢化可的松+10ng/mL EGF+双抗100μg/mL培养液培养。 胰酶消化法:浸洗、抗菌处理后将皮肤块切割成0.5 cm×1 cm左右的条状,用0.25%胰酶4 0C冷消化12 h。分离表皮与真皮。将表皮剪成糜状,过滤,接种。组织块培养法简单易行,组织块可重复利用,但原代细胞脱出时间较长,平均8 d,需15 d以上才能传代,原代传代通常采用差别消化法。季节对细胞脱出时间、原代传代时间、传代数有显著影响。春夏季细胞迁出时间(4.9±1.4 d)和原代细胞传代时间(10.3±2.5 d)比秋冬季短(10±1.5 d,20.3±1.7d),传代数(7.4±3.5代)比秋冬季多(4.5±1.5代);DispaseII酶消化法周期短,8d左右即可传代,细胞平均传代次数为6.5代。不同季节所得细胞无显著差异。但处理麻烦。用本法最高传14代仍无明显分化。胰酶消化法分离细胞数量远活力很差,难以长期传代,平均仅传3.2代。与组织块培养法、DispaseII酶消化法在传代数上均差异极显著(p0.01)。 2.山羊皮肤干细胞的生物学特性 显微镜下观察可见细胞胞体透亮、体积小、球形、致密,核质比高,数日后呈镶嵌多角形,铺路石样生长,存在典型克隆团,有时出现PGCs样集落。 分离培养的细胞体外增殖能力强,增殖能力下降。目前已传至第14代。细胞贴壁能力对黏附底物依赖性强,有无底物细胞贴壁率差异显著,细胞在不同底物上生长贴壁
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2006
【分类号】:Q78

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