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磺胺甲基嘧啶单克隆抗体的制备与鉴定

侯玉泽  
【摘要】: 磺胺类药物是预防和治疗细菌感染性疾病的重要药物。由于具有经济、使用方便、化学性质稳定及治疗某些疾病有特效等特点,使之在畜牧业生产上的应用十分普遍。由于大量或长期使用,使得磺胺类药物在体内蓄积,造成其在动物组织内残留,人类食用被污染的动物食品后,可导致机体内正常菌群产生耐药性,引起人的中毒或者过敏性反应,许多国家和组织规定了其最高残留限量(MRL)为0.1mg/kg,甚至不得检出。 国内外已建立了很多理化方法检测动物性食品中残留的磺胺药。尽管该法比较灵敏、精确,但样品前处理繁琐、操作步骤冗长,需耗费大量溶剂,费用高,限制了它的广泛使用。作为一种快速、灵敏、特异的方法,酶联免疫吸附测定法正逐渐应用于药物的残留检测。 作为一种重要的磺胺类药物,磺胺甲基嘧啶(SM1)在磺胺类药物的使用中占很大比例。它的分子量为264.38,为半抗原。分子结构中具有芳伯氨基,可进行重氮化反应与载体蛋白连接。本研究在分析磺胺甲基嘧啶免疫特性的基础上,选用牛血清白蛋白(BSA)作为连接载体,同时进行磺胺甲基嘧啶与卵清蛋白(OVA)的偶联,运用单克隆抗体技术生产出磺胺甲基嘧啶的单抗,为建立磺胺甲基嘧啶的免疫学检测方法提供了关健的材料。主要研究结果如下: 1、试验一分别用戊二醛法和重氮化法把半抗原SM1和载体蛋白BSA、OVA偶联制备了全抗原,并利用SDS-PAGE和紫外扫描做了相应的鉴定。 2、试验二采用戊二醛法连接的人工抗原免疫动物以后没有抗体产生;重氮化法将磺胺甲基嘧啶和BSA的偶联的产物SM1-BSA免疫动物以后产生了高效价的抗体。 3、试验三利用业已成熟的单克隆抗体技术,用SM1-BSA抗原免疫Balb/c小鼠,将免疫小鼠脾细胞与NS0瘤细胞用50%的PEG4000进行细胞融合,用HAT培养基筛选培养,以SM1-OVA包被抗原检测杂交瘤细胞培养上清,获得了112株产生磺胺甲基嘧啶抗体的杂交瘤细胞株。对强阳性克隆以有限稀释法连续克隆三次,建立了3株分泌高亲和力的抗SM1单克隆抗体杂交瘤细胞株SM12B1、SM13H5、SM14E11,培养上清的ELISA效价分别为1:512、1:640、1:320。以此三株杂交瘤细胞,腹腔注射Balb/c小鼠诱生腹水,其ELISA效价分别为1×10-7、1×10-7、5×10-6。这些单抗与其他SAs以及药品的交叉反应率很低(0.4%)。


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