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《西北农林科技大学》 2007年
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小麦低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1在毕赤酵母中表达的探索

崔巍  
【摘要】: 小麦(Trticum aestivum)是我国乃至世界的主要粮食作物之一,其种植面积约占谷物种植面积的30%左右。小麦面粉可以加工成各种不同的食品,是人类植物蛋白质的重要来源,因此,对小麦的研究一直是人们关注的热点。小麦贮藏蛋白中的高、低分子量谷蛋白亚基是决定小麦面粉品质优劣的重要因素。低分子量麦谷蛋白亚基(LMW-GS)是小麦种子中一类重要的贮藏蛋白,占面筋蛋白的40%。研究表明,低分子量麦谷蛋白亚基与面粉的加工品质密切相关,它与高分子量麦谷蛋白亚基(HMW-GS)共同决定着面筋强度。高、低分子量麦谷蛋白亚基通过分子间二硫键形成麦谷蛋白大聚合体(GMP);谷蛋白大聚合体的含量、组成和粒度分布影响面团的特性。麦谷蛋白亚基的类型和数量决定了大聚合体的大小和数量。因此,可以通过选择优质麦谷蛋白亚基,改变聚合体的组成,提高大聚合体的含量来改良面团的加工特性。 本研究以本课题组构建的含小偃6号低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的重组质粒pGEM-XYGluD3-LMWGS1为模板,利用PCR技术扩增出基因XYGluD3-LMWGS1的完整编码区,构建成酵母表达载体,电激法转化酵母,并对转化子进行目的基因XYGluD3-LMWGS1进行蛋白诱导表达研究,研究取得以下结果: 1.通过PCR扩增得到低分子量麦谷蛋白基因XYGluD3-LMWGS1的完整编码区,构建了克隆载体pMD18-simple T-XYGluD3-LMWGS,通过酶切对克隆载体进行了鉴定和测序,证实所获得的基因编码区序列与克隆的XYGluD3-LMWGS1中的可读框序列完全一致。表明基因XYGluD3-LMWGS1基因已经克隆进PMD18-simple T中。 2.将克隆载体pMD18-simple T-XYGIuD3-LMWGS和酵母表达载体pPIC3.5K用相同的限制性内切酶切割,回收目的片段,用T4 DNA连接酶将两者连接,筛选得到重组酵母表达载体,经酶切鉴定和测序,XYGluD3-LMWGS1基因已经正确连接到pPIC3.5K上。3.用电激法将重组酵母表达载体导入甲醇型酵母(Pichia.pasteoris)菌株GS115中,获得转化子,将转化子进行PCR筛选,得到酵母重组菌株。 4.在以甲醇为唯一碳源的培养基上培养,对重组酵母菌株进行了诱导表达。经过SDS-PAGE电泳检测,未发现目的蛋白表达,对诱导表达条件和目的基因序列进行分析发现,目的基因中酵母非偏爱密码子占总密码子的42%,大量稀有密码子的使用可能导致翻译过程中出现瓶颈效应,以及诱导时的PH值,温度及蛋白水解酶等因素可能最终导致目的蛋白的不表达。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q943.2;S512.1

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【参考文献】
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