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《西北农林科技大学》 2007年
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猪瘟病毒囊膜蛋白基因重组质粒pcDNA4.0-E的构建及免疫学研究

白华  
【摘要】: 猪瘟(classical swine fever, CSF)是一种严重威胁养猪业的疾病,目前,防治猪瘟最主要的方式为注射弱毒疫苗的免疫接种,但由于传统弱毒疫苗存在着许多不足,使得研制高效而更具特异性的新型猪瘟疫苗成为当务之急,而猪瘟病毒DNA疫苗无疑是可能的途径之一。猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)属于黄病毒科(Flaviridae)瘟病毒属(Pestivirus),其病毒基因组RNA只有一个大的开放阅读框(ORF),编码11个结构蛋白和非结构蛋白,其中结构蛋白E0、E1、E2为病毒囊膜糖蛋白。E2可诱导中和抗体的产生,是猪瘟病毒主要抗原蛋白,E0也能诱导产生中和抗体,且其编码序列较E2保守,因此在猪瘟的防治和诊断方面也有巨大的应用潜力,E1虽然没有抗原性,但对E0和E2的加工成熟有重要作用。本研究以猪瘟病毒石门株RNA序列为模板,应用RT-PCR技术首次构建了包含猪瘟病毒全部囊膜蛋白(E0、E1、E2)基因序列的真核表达重组质粒pcDNA4.0-E,并作为疫苗免疫小鼠和仔猪,以检验所构建DNA疫苗的免疫保护作用。本研究由3部分构成: 1.采用RT-PCR方法克隆得到猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E0-E1-E2的基因序列,并将其定向插入真核表达质粒pcDNA4.0多克隆位点,琼脂糖电泳和测序表明,成功地构建了包含猪瘟病毒全部囊膜蛋白基因序列的重组质粒pcDNA4.0-E,从而为动物免疫试验奠定了基础。 2. pcDNA4.0-E重组质粒转化E.coli JM109后,经过提取和纯化,小鼠后肢胫前肌注射100μg/只(50μg/腿),共2次,间隔15 d。第2次免疫后第10 d、20 d、30 d分别采血并捕杀小鼠,间接ELISA法检测血清抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾脏和外周血中淋巴细胞转化增殖。结果显示,血清抗体水平从第2次免疫后的第10 d开始逐渐升高,且极显著高于空白对照组(p0.01=;对淋巴细胞转化增殖试验的数据进行统计分析结果显示,与空白对照组相比,所得重组质粒也能够显著增强小鼠脾细胞和外周血淋巴细胞增殖(p0.05)。这些说明所构建的重组质粒能够诱导小鼠产生特异性抗体和增强细胞免疫。 3. pcDNA4.0-E重组质粒转化E.coli JM109后,经过提取和纯化,仔猪四肢肌肉注射,共注射2次,第1次免疫完成后第15 d进行第2次免疫,每猪每次注射4 mg(1 mg/腿)。1免后第0 d开始,每隔5 d以ELISA试剂盒检测抗体水平,结果表明1免后第20 d开始,pcDNA4.0-E免疫组抗体水平均显著高于空白对照组(p0.05),说明pcDNA4.0-E可以诱导产生特异性抗体。1免后第40 d以猪瘟病毒石门株强毒进行攻毒试验,结果显示与空白对照组猪相比,免疫组猪体温升高时间普遍推迟,在临床症状和大体剖检变化方面也较轻微,病理组织学检查也显示免疫组试验猪组织病变程度较空白对照组猪轻微。空白对照组猪全部死亡而免疫组猪2头存活,这说明pcDNA4.0-E对试验猪具有一定的保护作用。如何提高重组质粒的保护效力尚需进一步研究。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S852.5

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【引证文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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【参考文献】
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