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植物染色体BAC文库的构建与内多倍化特点的流式分析

郭东伟  
【摘要】: 流式细胞术是六、七十年代发展起来的一项综合了激光、电子、化学等多技术领域的高新测量技术,能够实现对细胞的多参数快速测量、大规模分析和高精度分离,业已在医学临床诊断和研究中得到普遍应用。从80年代开始,该技术逐渐被运用于植物细胞生物学研究,在植物DNA含量测定、细胞周期测量、大规模细胞培养的监控、特定染色体的分离等领域显示了巨大潜力,但国内相关研究几乎处于空白。本研究分别以普通小麦及其双端体为材料,以发展和推广流式细胞术在植物学研究中的应用为目的,着重研究和优化了小麦染色体BAC文库构建时根尖细胞同步化方案的确立,染色体的流式分析、分选与鉴定,高分子量DNA和载体的制备与纯化,连接与转化、BAC克隆的检测等关键环节的操作条件,确立了一套完整的染色体BAC文库构建技术体系;同时还运用细胞核DNA含量的流式测定技术对甘蓝及其近缘种属中的内多倍化现象进行了系统研究,指出了内多倍化现象在不同种属、杂交世代、组织器官及发育时期的分布特点。填补了相关研究的国内空白,以期为未来的小麦基因组测序、植物基因组进化等研究提供理论依据,为我国今后在植物细胞流式术研究领域追赶国际前沿提供技术支撑。 根尖细胞分裂周期同步化是进行植物染色体流式分离的前提,但不同基因型根尖细胞有丝分裂各阶段持续的时间不同,所以现有的同步化方法并不具普遍适用性,急需一套完整的判断标准,来评价同步化各阶段的最佳处理时间和目标,为未研究植物的根尖同步化方案的确定提供参考。在以小麦为材料进行根尖同步化研究时的结果表明:化学阻断剂能显著提高小麦根尖分生组织细胞的中期指数。同步化处理经历HU,恢复和氟乐灵处理三个连续的阶段,评判HU处理优劣的标准是是否使根尖细胞群保持了低的S期比例和高的G1期比例,本研究中这一最佳处理时间被确定为9h;恢复处理的目的是让DNA合成受到抑制的细胞迅速恢复合成,其评判标准是恢复后能否保持一个高的S期细胞比例,在流式核型图上能否显示一个清晰的S期峰,本研究中恢复2-4h或6-7h处理可使细胞快速进入合成期;3.5-6h的氟乐灵处理可使细胞集中在中期,此时可在流式核型图上看到明显的染色体峰;此阶段处理的评价标准是能否保持尽可能高的G2/M期细胞比例。冰水处理前后的流式核型差异不大,因此,对有些材料,冰水处理并非必需,其作用可能在于使细胞积聚更多的中期染色体。 快速分离大量高纯度目标染色体是实现染色体文库构建的基础,这其中涉及高质量染色体悬浮液的制备、分析与分选条件的优化、染色体的分选与鉴定等操作环节。研究表明:同步化处理后的根尖经2%多聚甲醛4℃固定20min,可阻止细胞分裂并能改善染色体悬液的质量。9600rpm,12S的机械匀浆可使大部分细胞中的染色体得到有效释放,制备的染色体悬浮液背景清晰,染色体结构完整,能以单个粒子的形式悬浮在缓冲液中。染色体悬浮液用2μg/ml终浓度的DAPI染色30min,可得到高的流式核型分辩率。CV低于2.0%的仪器状态下,以低于20个粒子/秒的速度进行分选可保持较高的分选纯度,分选染色体可通过FISH、PCR和CPRINS法进行鉴定,以C-PRINS最具潜力,PCR则更加快速简单,三种方法可互相配合使用。 尽管BAC文库构建技术已日趋成熟,但由于制备高分子量DNA的材料不同,以染色体为材料构建BAC文库在操作方法上又有其特殊性。研究结果显示:分选染色体以80万条为单位制备胶块,再用10UBamHI酶切15min能够使大部分DNA处于100-400bp之间,以透析袋回收的高分子量DNA浓度在4ng以上,可满足建库对HMWDNA浓度的要求,兼顾了HMWDNA制备的效率和质量。将纯化、酶切、脱磷处理后的质粒载体BIBAC与HMWDNA按照1:4比例连接。再按连接产物与感受态细胞1:20的比例电击转化,转化效率可达到1500个克隆每200μl复苏液,随机挑取30个单克隆,NotI酶切,脉冲电泳显示插入片段超过100kb。染色体DNA降解是研究中遇到的主要问题,这一现象主要发生在去蛋白过程中,通过改变染色体分离液的pH值、成份或酶切前做6-8h预电泳可减轻降解带来的不利影响。 鉴定种间杂种是利用远缘杂交创造新种质时的一项重要工作,本研究运用细胞核DNA含量流式测定技术,对甘蓝和白菜杂交及回交各世代的DNA含量进行检测,以监控遗传物质在不同材料间的流向,并从回交二代植株群体中筛选了两个材料,具有和白菜差异不显著的DNA含量,可推断其为核质杂种。与传统方法相比流式鉴定体现了简单快速,不受生育期影响、能进行大规模群体检测的特点。 内多倍化是种子植物中的一种普遍现象,分析植物不同种属及组织器官的内多倍化程度,对于植物的基因组进化研究有重要意义。本研究运用流式分析技术对甘蓝及其近缘种属进行了内多倍体分布特点的检测,结果证实:植物的内多倍化具有种属、组织器官、生长阶段和发育进程特异性,老熟的输导组织似乎比幼嫩的非输导组织有较高的内多倍化程度;最初,内多倍化程度能伴随器官的生长快速提高,达到一定程度,器官接近成熟时,内多倍化水平便保持在一个相对恒定的水平。植物的内多倍化是受核基因控制的,受体亲本的细胞质并没有影响内多倍化在回交二代中的分布。


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