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黄牛Orexin和Ghrelin基因遗传多样性研究暨Ghrelin基因高效原核表达系统构建

张爱玲  
【摘要】: 生长速度是家畜生长发育的一个重要性状,而食欲与生长速度密切相关,食欲旺盛的个体摄食量大,生长速度快,能较快达到成年体重,节省培育成本。增食欲素(Orexin)和胃饥饿素(Ghrelin)是两种重要的促进食欲的神经肽,前者属于中枢神经因子,后者属于外周神经因子,两者都通过位于下丘脑的食欲调节网络来进行食欲调节。增食欲素和胃饥饿素能刺激家畜的食欲,提高采食量,同时调节能量平衡,具有很高的研究价值。但是目前只在人和小鼠上研究较多,在牛上研究很少。 开展对两种食欲促进因子基因的遗传多样性研究,将有望为培育食欲好、摄食量大、能量转化高的家畜品种提供分子遗传学资料。而对Ghrelin基因进行克隆和原核表达,则为黄牛增食欲微生态制剂的开发应用提供有价值的资料。本研究采用PCR-SSCP和测序的方法分析了我国3个黄牛品种共计283头个体(其中郏县红牛142头,南阳牛74头,秦川牛67头)Orexin和Ghrelin基因单核苷酸多态性,并分析了多态位点与部分牛生长发育性状的关系;同时通过基因工程技术构建了黄牛Ghrelin基因高效原核表达系统,实现了Ghrelin基因在大肠杆菌和枯草杆菌的高效表达,获得了以下重要研究结果: 1黄牛Orexin基因遗传多样性研究及与生长性状相关分析 在3个群体中283头个体O-2(-178~-818 bp)DNA片段上发现了3种基因型(A,B,C),4处突变,分别为-572 bp:T→C;-468 bp:C→T;-463 bp:A→T;-440 bp:A→G。同时在在O-5(-1752~-1394 bp)DNA片段上共发现了2种基因型(A,B),6处突变,分别为-1599bp:C→G;-1574bp:G→A;-1539 bp:T→C;-1537 bp:A→C;-1427 bp:C→T;-1420 bp:C→A。 3个群体在-1599 bp、-1574 bp、-1427 bp和-1420 bp处均处于哈代-温伯格平衡状态,其它6个SNP位点处于不平衡状态。对Orexin基因启动子区域进行转录因子结合位点预测,发现有8处位于转录因子结合位点, -572 bp(T→C)、-468bp(C→T)和-463bp(A→T)处突变分别发生在Evil1、RREB1和NFY结合位点的核心序列。 分析Orexin基因位点与南阳牛生长发育性状结果表明,O-2位点与南阳牛的6月龄体重、6月龄日增重和12月龄日增重均到了显著水平,O-2和O-5互作时,对6月龄体重、12月龄日增重达到了显著水平。O-5位点对其它性状没有达到显著水平。在O-2位点南阳牛仅仅检测到了B基因型和C基因型。不同基因型与秦川牛生长发育性状之间最小二乘均值差异显著性检验发现B基因型南阳牛6月龄和12月龄的体重和日增重显著高于C基因型个体,根据肉牛选育与适时屠宰的要求,生长时间短而又能尽快达到屠宰体重的要求,早期选留B基因型个体比较合适。O-2和O-5位点对秦川牛生长发育性状没有影响。 2黄牛Ghrelin基因遗传多样性研究及与生长性状相关分析 对3个群体的Ghrelin基因进行PCR-SSCP分析,在G-1(-544~+35bp)发现了A、B、C 3种基因型,4处SNP位点:-415 bp:A→G,-414 bp:T→C,-321 bp:C→A,-129 bp:A→G。 G-2(-1037~-509bp)处发现了A、B 2种基因型,1处突变,为-826bp:A→T。A基因型序列与GeneBank序列一致,B基因型为-826(A/T)。G-4(+4~+427bp)包括1、2外显子和1内含子,存在A、B 2种基因型,突变位点在:+205:C→T,+253:T→C。共7处SNP位点中,其中5处位于于启动子区,2处位于内含子1。 哈代-温伯格平衡检验只有秦川牛在-321bp处于遗传平衡状态。 Ghrelin基因多态位点与南阳牛生长发育性状相关分析,G-1与G-2,G-1与G-4,G-2与G-4均与南阳牛的生长性状之间不显著,只有G-1位点与南阳牛18月龄坐骨端宽呈显著差异,C基因型牛坐骨端宽显著大于B基因型牛,C型牛可以作为南阳牛肉用性状辅助选择的一个参考。G-1与G-2、G-1与G-4、G-2与G-4之间的互作没有对秦川牛生长性状影响,只有G-4位点对秦川牛的胸围呈显著差异(P=0.038),不同基因型与秦川牛生长发育性状之间最小二乘均值差异显著性检验,发现A型牛的胸围大于B型牛的胸围,A基因型可以作为秦川牛增重因子早期选育的一个辅助标记。 3 Ghrelin基因的克隆与高效原核表达系统构建 采集黄牛皱胃胃底腺组织,采用RT-PCR扩增黄牛的Ghrelin基因的CDS区,并将之构建到克隆载体pMD-18T上,得到阳性克隆载体pGh-T1。同时采用Overlap-PCR克隆了黄牛的Ghrelin基因的CDS区,构建克隆载体pGh-T2。测序结果表明该基因全长351bp,两种方法克隆得到的Ghrelin基因的CDS区序列是一致的,这证实了Overlap-PCR扩增已知基因全序列的可行性。将GhrelinCDS区导入到pET32a(+)载体骨架上,构建了Ghrelin大肠杆菌高效表达载体pGh-32,并得到了His-Ghrelin融合蛋白,大小为31kDa。可溶性分析该融合蛋白大部分以可溶性形式存在,一小部分以包涵体形式存在。免疫印迹试验可得到清晰的印迹条带,初步证实了所获的融合蛋白是特异的;将融合蛋白分离纯化后皮下注射家兔后获得了融合蛋白的多克隆抗体血清,ELISA检测血清的稀释效价在1:12800。黄牛下丘脑弓状核免疫组化试验进一步印证了大肠杆菌表达产物是有活性的,可用于进一步的研究。 枯草芽孢杆菌是一种革蓝氏阳性菌,安全无内毒素,为了实现Ghrelin基因在枯草芽孢杆菌表达系统的高效表达,用β-半乳糖苷酶作为报告基因,通过鸟枪法从枯草芽孢杆菌中筛选得到103个启动子克隆,获得1个在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中具有强表达活性的克隆,筛选得到的启动子片段命名为P3.4.23。该启动子片段具有原核基因启动子的保守结构,对该启动子与枯草芽孢杆菌基因组比对分析,该转录原件为yxiE基因的5'调控区。经过亚克隆改造,发现该启动子片段的转录活性部位位于5~333bp。同时构建了枯草芽孢杆菌高效表达载体pYG78。设计带有EcoRI和SacI酶切位点引物,从pGh-32载体上扩增GhrelinCDS,并将之连接到克隆载体上构建pGh-B-T,对阳性克隆pGh-B-T进行EcoRI和SacI酶切,将GhrelinCDS区切下来,然后与相应的pYG78双酶切的骨架连接,将Ghrelin基因CDS区构建到pYG78骨架上,获得了Ghrelin枯草芽孢杆菌表达载体pYG-Gh。SDS-PAGE分析表明Ghrelin基因在枯草芽孢杆菌中得到了表达,蛋白分子量为11kDa。上述研究为Ghrelin枯草芽孢杆菌微生态制剂奠定了基础。


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