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《西北农林科技大学》 2007年
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TGEV S基因的克隆、表达及转基因小鼠的制备

彭树英  
【摘要】: 转基因动物乳腺生物反应器是一种利用转基因技术在动物乳腺中特异高效表达多肽药物、疫苗、抗体等蛋白的技术。利用乳腺生物反应器生产重组蛋白具有效率高,成本低等特点,并且,表达的重组蛋白具有天然生物活性。用乳腺生物反应器生产的重组抗原蛋白疫苗能随着乳汁分泌,口服免疫动物后,能保护自身免受病毒的感染。由此可见,利用乳腺生物反应器制备重组抗原蛋白疫苗具有不可限量的应用前景。本研究构建了猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine, TGEV)纤突蛋白(Sipke protein, S)基因的乳腺特异性表达载体,在体外培养的小鼠乳腺癌细胞和小鼠乳腺中表达,验证其有效性,并尝试了用曲细精管注射法制备转基因小鼠,以期进一步验证用转基因动物乳腺生物反应器制备重组抗原蛋白疫苗的可行性。 采用RT-PCR和重组PCR扩增TGEV TSX毒株S基因cDNA序列,分离纯化PCR产物,连接到pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆pGEM-S,并对其进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,所克隆的S基因为4 350 bp(GenBank登录号DQ001167),编码1 449个氨基酸,N端前16个氨基酸为推测的信号肽序列,后1 433个氨基酸构成成熟蛋白;与GenBank中已发表的9个TGEV毒株S基因进行比较,核苷酸序列同源性为95%~98%之间;推导的氨基酸序列同源性在95%~98%之间。基于S基因及其推导氨基酸序列的聚类分析表明,TSX株与Miller,PUR46-MAD,TH-98,TS和HN2002株亲缘关系最近。与其他TGEV毒株比较,TSX毒株S基因中有10个碱基发生突变,造成10处氨基酸发生改变,但主要抗原部位未发生任何变异,为进一步研制猪传染性胃肠炎基因疫苗提供了良好的候选基因。 本研究将S基因插入到牛β-酪蛋白启动子5'调控区和3'端调控区之间,构成重组质粒pBS,利用SacⅠ/MluⅠ双酶切质粒pBS得到7.3 kb的bs基因片段,与经同样双酶切的真核表达载体pEGFP-C1进行定向连接,获得以牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白(Enhancer Green Fluorescent Protein,EGFP)为报告基因的TGEV S基因乳腺表达载体pEBS。 通过脂质体介导的方法将TGEV S基因乳腺表达载体pEBS转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,转染24~48 h后,在倒置荧光显微镜下观察转染效率;用G418进行抗性细胞克隆的药物筛选,2周后,提取G418抗性细胞克隆的基因组DNA和RNA,用PCR和RT-PCR方法检测出阳性转基因细胞克隆,然后扩大培养,加入胰岛素,氢化可的松和催乳素进行诱导表达。诱导48 h后,收获上清液,超滤浓缩目的蛋白。用ELISA检测S蛋白的表达情况,结果表明,在激素诱导下,S蛋白的最大表达水平为2μg/mL, Western blotting分析表明,重组S蛋白分子量为175 ku。 重组S蛋白免疫小鼠,免疫后,试验组小鼠体内开始持续产生抗体。在第一次加强免疫后,血清中特异性抗S蛋白抗体滴度达7.28±0.15 ng/mL,第二次加强免疫后达8.86±0.19 ng/mL;抗体中和试验表明,免疫后小鼠体内产生的抗血清能有效的抑制TGEV的感染。 将乳腺定位表达载体pEBS经过脂质体包裹后,通过乳腺导管直接注入妊娠后期小鼠的乳腺中,进行瞬时表达。于小鼠分娩后第1,5,10和15天收集乳汁。ELISA检测乳汁中S蛋白含量,结果表明,最大表达量为3.50μg/L。 将表达质粒pEBS与脂质体按一定比例混合,再加入适量的台盼蓝制成转染液,注入到小鼠睾丸中的曲细精管中,体内转染精原干细胞以探讨建立转基因小鼠的可行性。共注射了5只公鼠,其中2只术后死亡。存活的3只公鼠在术后第5天分别与2只发情母鼠合笼交配,共生仔鼠26只。对26只子代小鼠应用PCR技术进行了检测,检测结果表明,其中8只呈PCR阳性。随后应用Southern blotting技术对PCR阳性的8份小鼠基因组进行检测,结果有2份为阳性。证实了体内精原干细胞转染建立转基因动物的可行性。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:Q78

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