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《西北农林科技大学》 2007年
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猪FoxO1基因cDNA的克隆及对前体脂肪细胞和成肌细胞分化的调控作用

庞卫军  
【摘要】: 随着人们生活水平的提高,消费者对肉类产品的质量提出了更高的要求,不仅要求肉品瘦肉率高、脂肪分布适中,而且要求肉品优质。目前,肉产品的数量已能满足人们的消费需求,但其品质却越来越差。因此,研究肉质形成及其分子机理成为目前家畜育种科研工作者关注的焦点。导致肉质变差的因素很多,主要有脂肪的沉积部位发生改变,如肌内脂肪含量下降、皮下脂肪和腹脂沉积过多以及肌纤维颜色变苍白、肌纤维类型比例失调、PH值下降等。脂肪细胞和肌细胞是动物脂肪组织和肌肉组织主要组成单位,分别由前体脂肪细胞和成肌细胞分化而来,两类细胞的增殖与分化状况对脂肪形成和肌形成起关键作用。近年来研究表明,在啮齿动物鼠及其细胞系中,叉头转录因子O亚家族1(forkhead transcription factor group o1,Foxo1)可能是前体脂肪细胞和成肌细胞分化过程的重要调控因子,通过多条通路影响细胞增殖、分化、凋亡和细胞周期以及葡萄糖代谢和氧化应激等,暗示小鼠Foxo1在脂肪细胞和肌细胞的形成过程中发挥重要的调控作用。 体脂沉积是脂肪细胞内甘油三脂聚积、脂滴从无到有、从多室变为单室的过程,实质是前体脂肪细胞增殖、分化及肥大共同作用的结果;而肌形成则是成肌细胞融合为肌管,进而成为多核的肌纤维的过程。前体脂肪细胞和成肌细胞原代培养体系为研究细胞分化及调控提供了一个可操作模型。推测猪FoxO1很可能与其它转录因子组成网络共同调控成脂和成肌过程。本实验首先通过RACE技术克隆了猪FoxO1 cDNA全长,并对其进行了序列分析和蛋白结构与功能的预测;其次,利用猪×仓鼠体细胞辐射杂种克隆板(IMpRH7000-rad)对FoxO1基因进行染色体精细定位,并运用Realtime PCR和Western blotting技术分析了猪FoxO1基因组织表达规律;再次,运用细胞培养技术研究了不同浓度的百藜芦醇和IGF-1对猪前体脂肪细胞和成肌细胞增殖与分化的影响,并初步探讨了可能的作用机理;最后,运用脂质体转染和RNAi技术研究了FoxO1对猪成肌和成脂关键基因时序表达的调控作用,获得如下结论: 1.猪FoxO1基因cDNA克隆、序列分析及其蛋白结构与功能预测。5'和3'RACE克隆测序后,去掉载体序列、引物序列和重复的部分已知序列,经拼结得到cDNA全长序列2335bp,其中含有起始密码子ATG和终止密码子TGA,polyA序列,Genebank登陆号EF453379。运用生物信息学预测,猪FoxO1基因氨基酸序列长度为662AA,蛋白质分子量为69.93kD,等电点pH为6.295;具有Forkhead DNA结构域(AA 165-255),跨膜结构(AA90-113),但无信号肽;磷酸化位点预测结果显示含有51个Ser、8个Thr和4Tyr磷酸化位点;蛋白二级结构推测含有螺旋构象(helix)22%,折叠构象(sheet)19%,转角构象(turn)24%,无规则卷曲(coil)35%;预测了猪FoxO1 mRNA的二级结构,其结构的自由能为-671.5 kcal/mol。 2.猪FoxO1基因染色体精细定位及其组织表达分析。运用RH辐射克隆板方法研究发现,猪FoxO1基因与标记SW1632紧密连锁,与SW1632的遗传距离为0.32cR,两点分析结果LOD值为12.17,故将猪FoxO1基因定位于11p13。组织表达分析发现,初生和180日龄时猪皮下脂肪、腹腔脂肪和肝脏组织FoxO1基因表达均相对较高,骨骼肌组织FoxO1基因表达则相对较低;初生与180日龄猪相比,相应组织中FoxO1表达量较高(P0.05),提示猪FoxO1在这4种组织中可能发挥重要生理作用。 3.百藜芦醇和IGF-1分别以剂量和时间依赖的方式抑制和促进猪前体脂肪细胞增殖与分化,以100μmol/L RES组和100 ng/mL IGF-1组作用最为明显,其机理可能与FoxO1 mRNA的上调或下调而导致PPARγmRNA表达变化有关,其中Sirt1可能起到辅助调节的作用。 4.百藜芦醇和IGF-1分别以剂量和时间依赖的方式抑制和促进猪成肌细胞增殖与分化,以160μmol/L RES组和45 ng/mL IGF-1组作用最为明显,其机理可能与FoxO1 mRNA的上调或下调而导致MyoD mRNA表达变化有关。 5.成功构建了猪FoxO1干扰表达载体。以原代猪前体脂肪细胞和成肌细胞为模型的研究中,证实脂质体的转染效率明显高于磷酸钙沉淀法。构建了3个猪FoxO1 siRNA表达载体,分别为pBS/U6-FoxO1-952、1303和1748,并运用脂质体转染猪前体脂肪细胞和成肌细胞,经RT-PCR和免疫荧光检测发现pBS/U6-FoxO1-1748对细胞内源FoxO1的抑制效果最明显。 6.内源FoxO1表达的抑制可导致猪前体脂肪细胞和成肌细胞增殖与分化能力增强,原因很可能与关键成脂基因PPARγ、A-FABP、H-FABP、Sirt1、LPL和GADD45α及成肌基因MyoD、MEF2C、CaMKII、Sirt1、NFAT、MyoG、IGFBP5和GADD45α表达上调或下调有关。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:S828

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【引证文献】
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【参考文献】
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9 崔久彩;急性应激对海马Akt/FKHRL1信号通路活性改变的影响[D];浙江大学;2011年
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【同被引文献】
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7 经济学家温铁军○本报记者杨晓平;无法克隆的现代化[N];中华工商时报;2002年
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