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《西北农林科技大学》 2007年
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利用T4扩增技术检验大肠杆菌方法的模型研究

刘邻渭  
【摘要】: 利用噬菌体技术检测细菌是一类现代细菌检验方法,根据具体展开时的技术差异,又分为噬菌体扩增技术、发光噬菌体技术和裂解产物分析。噬菌体扩增技术将每个活宿主菌转变为一个噬菌斑,根据噬菌斑计数结果检出宿主菌的活菌含量;发光噬菌体技术可使宿主菌发光,直接在落射荧光显微镜下计数,或通过宿主菌繁殖噬菌体而增加发光强度,间接定量宿主菌的活菌含量;裂解产物分析通过测定噬菌体裂解宿主菌释放特异物质产生的信号而定量宿主菌的活菌含量。这些方法速度快、灵敏度高、专一性强且费用低廉。其中后两种技术用于检验大肠杆菌的研究已有报道,但用相对更经济的第一种方法检验大肠杆菌的研究尚属空白。 本研究以T4和三种E. coli菌株为模型材料,研究运用噬菌体扩增和实时PCR复合技术快速检验细菌的方法。整个研究包括五个部分。1、寻找能在很短时间内将模拟样品中T4宿主型大肠杆菌有效而完全侵染所需的T4浓度。2、建立离心-微滤复合技术,清洗掉样品中游离T4和其他杂质。3、建立受侵染大肠杆菌在膜组件内裂解产生子代T4并洗脱和收集T4形成转换样品的适当方法。4、建立转换样品子代T4含量和模拟样品大肠杆菌活菌含量之间的数量关系。5、建立运用噬菌体计数法、PCR和实时PCR定量测定转换样品子代T4含量的适宜技术。最后,指明本模型研究的主要进展和存在的问题。 第一部分研究结果表明:能够在5min内有效而完全侵染液态模拟样品中T4宿主型大肠杆菌所必须采用的T4滴定度为109-108PFU/mL,最好为5×108PFU/mL。因为T4用量减少会发生漏侵染,T4用量过多则会增加下一步试验中清除游离T4的负担。在完成侵染过程后,应该立即进入离心-微滤复合清洗步骤,以避免多重侵染的发生。 第二部分研究结果表明:对于单纯以大肠杆菌配制的模拟样品, LB或TS肉汤是离心-微滤复合清洗样品中游离T4和其他杂质的最佳清洗剂。对于真实样品,宜用大肠杆菌选择性液态培养基作为清洗剂,从而限制样品中其他微生物的生长。先经两次离心法清洗与分离,使样品中大部分游离T4随上清液弃去,接着将包含受侵染大肠杆菌在内的沉淀物重新分散于肉汤,转移到孔径为0.2-0.22μm的聚砜或甲基纤维素注射式微滤膜组件中,再用90mL LB肉汤连续以微滤方式清洗与分离,将样品中剩余的游离T4清除,并将已受侵染的大肠杆菌截留在膜组件中。整个清洗操作在30 min内完成,所以清洗中不损失子代T4。 第三部分的研究结果表明:截留在膜组件内的受侵染大肠杆菌宜在膜组件内完成产生子代T4的过程。在结束清洗时,使用一次性使用针管和针头帽将膜组件封闭以防样品被环境污染,转入37℃培养箱保温,受侵染的大肠杆菌依靠膜组件内剩余的肉汤提供营养,绝大多数在50min内完成裂解。在保温90min时,使用定量的SM buffer洗脱膜组件中子代T4,收集滤出的洗脱液就得到转换样品。转换样品组成相当简单,它不含有细胞和杂质,介质为SM buffer,残留的游离T4很少且含量稳定,只有子代T4和大肠杆菌裂解产生的可滤出物的数量未知,为定量分析子代T4的理想样品。 根据以上研究结果和T4测定方法,本研究确立了液态模拟样品的系统转换方法。当采用噬菌斑计数法测定T4含量时,样品转换法如下:向0.9mL液态模拟样品中加入0.1mL的T4工作液(T4滴定度≥4×109PFU/mL)形成1mL起始样液,轻轻振摇中于37℃保温5min,接着在12000rpm下离心2min,弃去上清液,沉淀重新分散在1mL LB肉汤中,重复相同的‘离心-重新分散’操作两次,将最后一次重新分散液完全转入膜孔为0.2-0.22μm的聚砜或甲基纤维素注射式膜组件中,经过9次微滤式洗滤(每次用10mL LB肉汤并弃去滤液)后,保持针管和膜组件连结,并在膜组件出口戴上一次性使用的针头帽,将封闭的膜组件转入37℃培养箱,保温90min时取出,用10mL SM buffer洗脱子代T4,收集滤液得到转换样品。当采用PCR或实时PCR法测定T4含量时,样品转换法除一点改动外,其他完全与上述样品转换方法相同。这一改动是:用1mL SM buffer代替10 mL SM buffer洗脱并收集子代T4。 第四部分的研究结果表明: 将Escherichia coli B,Escherichia coli K 12或Escherichia coli AMC 198(代表T4宿主型大肠杆菌菌株)配制的模拟样品用上述方法进行样品转换,模拟样品T4宿主型大肠杆菌活菌数的对数和转换样品子代T4数量的对数呈线性关系,通过试验数据的回归分析,这种关系展示为一元线性回归方程。理论分析说明:决定该方程的斜率和截距的因素包括样品转换中受侵染大肠杆菌的营养供给、使用的清洗剂种类、使用的膜组件、参试的大肠杆菌菌株和样品转换的试验操作方法。 Pseudomonas fluorescens或Citrobacter Froundii(代表T4宿主型大肠杆菌以外的其他微生物)存在于样品中时不引起转换样品子代T4含量增加,但它们具有争夺营养而降低受侵染大肠杆菌产生子代T4数量的可能性,应通过样品转换中供给受侵染大肠杆菌充足营养并采用大肠杆菌选择性培养基为清洗剂而加以消除。 当样品转换中采用大肠杆菌选择性培养基为清洗剂、固定采用一种膜组件、注意保证供给受侵染大肠杆菌充分的营养和保持操作方法始终如一时,样品中T4宿主型大肠杆菌数量对数和转换样品子代T4数量对数间的一元线性回归方程就只和参试菌株有关。所以,从一类样品中分离出大肠杆菌做为混合参试菌株进行模拟试验得出的方程,可在以后检验同类样品的T4宿主型大肠杆菌活菌含量时应用。第五部分的研究结果表明: 噬菌斑计数法是测定转换样品T4含量的可靠方法之一,将它和第一种样品转换方法结合形成的T4宿主型大肠杆菌检验方法简单可行,该方法测定模拟样品时的检测极限约为20CFU/mL,整个检验过程需时8-9h。 PCR可作为粗略定量测定转换样品中T4含量的一种方法。源于T4 ligase基因序列的一对引物的专一性和灵敏度较高,这对引物用于PCR时的最适退火温度为58℃。将换样品制成模板样液时使用水煮法的效果相当良好。以系列转换样品制成系列模板样液,在优化的条件下进行PCR和电泳分析,可以区别系列转换样品中T4含量的差异,检测极限为500PFU/mL。 实时PCR可以精确测定转换样品T4含量。采用Light Cycler Fast Start DNA Master plus SYBR Green I复合试剂的扩增效率明显高于采用普通实时PCR试剂。当采用这种复合试剂和Lig F和Lig R引物时,适宜的实时PCR条件为:各引物的浓度控制为0.5mM,反应体系总体积为20μL,模板样液用量为5μL,退火温度和时间为61℃和5sec,延伸温度和时间为72℃和10sec,第一个循环的变性温度和时间为95℃和5min,其他循环的变性温度和时间为95℃和8sec。当以浓度10倍递减的T4 DNA水溶液为系列模板样液进行试验时,实时PCR扩增曲线等距排列,系列Ct值等差递增,熔点曲线仅含特异扩增产物峰,其熔点约为82℃;当以水煮系列转换样品制备的系列模板样液进行试验时,实时PCR扩增曲线依次排开,系列Ct依次递增,检测极限约为35PFU/mL。表明实时PCR可作为高灵敏度定量测定转换样品T4含量的一种方法。将它和样品转换法以及水煮法制备模板样液的技术结合,可在3.5h以内完成T4宿主型大肠杆菌的定量检测。 总之,本研究开创了一种快速检验T4宿主型大肠杆菌的方法。它通过2h的样品转换过程将T4宿主型大肠杆菌以确定的数量关系转换为子代T4,再通过1h左右的实时PCR分析过程测出转换样品中子代T4的数量,接着就可计算出样品中T4宿主型大肠杆菌的活菌数。这种方法不能测定非T4宿主型大肠杆菌,需要找出能够侵染各种大肠杆菌的噬菌体代替T4解决这一问题。虽然存在这种缺陷,但本方法作为一种具有广泛利用空间的新技术雏型,预计有良好的发展和应用前景。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R378

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【参考文献】
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1 吴健敏,涂长春,任兆钧;T4噬菌体表面展示技术的研究进展[J];病毒学报;2004年04期
2 马颖,龙腾锐,方振东;PCR技术检测饮用水中大肠杆菌[J];中国给水排水;2004年09期
3 黄辉萍,许能锋;消毒剂灭活病毒效果的评价方法及其研究进展[J];国外医学.病毒学分册;2005年02期
4 李军生,叶云,梁超香,何仁;免疫检测技术在食品检验中的应用[J];广西工学院学报;2005年01期
5 龚鑫萍,马炳荣;微过滤在除菌处理中的应用[J];膜科学与技术;2002年02期
6 陈思;黄昆仑;许文涛;李媛;罗云波;;实时荧光定量PCR方法检测大肠杆菌O157:H7[J];农业生物技术学报;2006年05期
7 陈萍,李仁宽,徐小华,饶平凡;毛细管电泳法快速分离和检测肠毒性大肠杆菌[J];色谱;2002年05期
8 吴健敏,任兆钧,余兴龙,涂长春,张念祖;利用T4噬菌体展示猪瘟病毒E2抗原[J];中国生物工程杂志;2004年11期
9 杨继章,陈大华,杨树民;抗病毒药物的研究进展及临床应用[J];上海医药;2005年08期
10 杨玉志,张春秀,唐祖明,陆祖宏;毛细管电泳在微生物分离与检测中的应用[J];微生物学杂志;2005年04期
【共引文献】
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1 邓强;王春晓;鲁建章;朱政;刘承初;刘景晶;;牛乳铁蛋白抗菌肽(Lactoferricin)基因的克隆与表达质粒构建[J];安徽农业科学;2008年11期
2 梁伟东;乐科易;马怡静;常城;金建中;;酿酒酵母菌关键酶基因剔除对谷胱甘肽合成的影响[J];安徽农业科学;2008年17期
3 毕波;王瑜;袁庆华;;SCAR分子标记在植物抗病育种中的应用[J];安徽农业科学;2010年30期
4 尤超;赵大球;梁乘榜;周春华;;PCR引物设计方法综述[J];现代农业科技;2011年17期
5 王娜;何苗;施汉昌;;环境中大肠杆菌快速生物检测技术研究进展[J];安全与环境学报;2006年03期
6 张博;郑岚;黄宇闻;莫琴;王迅;钱开诚;;荧光定量PCR技术评价亚甲蓝光化学法病毒灭活效果的研究[J];病毒学报;2009年04期
7 卢锐;叶永亮;冯国军;;EST-SSR标记在黄瓜F_1种子纯度鉴定中的应用[J];北方园艺;2010年18期
8 刘念;胡婧;黄原;;应用长PCR扩增蝗虫线粒体全基因组[J];动物学杂志;2006年02期
9 张博;郑岚;钱开诚;;核酸扩增技术评价血液病毒灭活效果的研究进展[J];中国输血杂志;2009年02期
10 王志平;周建超;张振中;付蕾;;PEI/ASON纳米组装体对肺腺癌A549细胞增殖活性及其hTERT基因表达的影响[J];第三军医大学学报;2012年08期
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1 郭新军;拟黑多刺蚁肌细胞增强因子2与肌钙蛋白Ⅰ亚基基因的克隆及其在发育中的表达研究[D];陕西师范大学;2010年
2 张博;亚甲蓝光化学法对血液及血制品中淋巴细胞及病毒的灭活效果及其机理[D];华东师范大学;2011年
3 刘念;三种蝗虫线粒体基因组测序与直翅目比较线粒体基因组学分析[D];陕西师范大学;2011年
4 李石柱;应用现代生物信息技术对湖北钉螺遗传多样性的研究[D];中国疾病预防控制中心;2009年
5 姚远;神经肽S及其受体在猪体内的分布和对猪免疫调节功能影响的研究[D];南京农业大学;2011年
6 何进;几种微生物及其代谢产物的毛细管电泳方法研究[D];华中农业大学;2003年
7 高焕;中国对虾基因组串联重复序列分析及其分子标记的开发与应用[D];中国科学院研究生院(海洋研究所);2006年
8 丁矛;昆虫抗药性相关基因芯片的研制及其应用[D];浙江大学;2006年
9 肖尚友;相互作用分析的毛细管电泳方法研究与应用[D];重庆大学;2006年
10 栾生;日本囊对虾基因组串联重复序列分析及微卫星标记的开发与应用[D];中国海洋大学;2006年
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1 王卫杰;食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7和鼠伤寒沙门氏菌同时快速检测方法的研究[D];山东农业大学;2010年
2 徐皓亮;HIV-1转录抑制剂的研究[D];华东理工大学;2011年
3 袁雪婵;烟草中菌核净农药残留检测技术的研究[D];昆明理工大学;2009年
4 王红波;矮牵牛组织培养体系的建立和ACO基因cDNA的克隆[D];中南林业科技大学;2010年
5 梁磊;环介导等温扩增(LAMP)技术检测牛肉中大肠杆菌O_(157)的研究[D];河北农业大学;2011年
6 魏鑫;甜高粱SPS基因表达及其对糖分含量积累的影响[D];沈阳师范大学;2011年
7 高鸿雁;大肠杆菌微生物传感器的性质及大肠杆菌代谢动力学研究[D];沈阳师范大学;2011年
8 邢昕;达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)冬眠以及育肥期间能量平衡调节机理的研究[D];沈阳师范大学;2011年
9 代莉;PARL基因Leu 262 Val多态性与PD、T2DM及DN的相关性研究[D];昆明医学院;2011年
10 耿计伟;乳腺癌特异性转导多肽介导的HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及其体外靶向效应研究[D];昆明医学院;2011年
【二级参考文献】
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1 许国双;黄长形;杨为松;;表面展示技术研究进展[J];国外医学(免疫学分册);1998年03期
2 何明俭;病毒唑治疗病毒性上呼吸道感染30例疗效观察[J];广州医药;1996年05期
3 张子群,李维刚,金宁,梁建新;应用酶联免疫技术检测动物源性食品中四环素类抗生素残留的研究[J];黑龙江畜牧兽医;2003年03期
4 李艳华,田国彬,李雁冰,包红梅,陈化兰;CID20对禽流感病毒的灭活作用[J];黑龙江畜牧兽医;2003年10期
5 刘波,贾红,李晓华,罗永松,张德云,史明坤,叶青,王玉,王志刚,徐朝阳,姜潮,曲玉环,王术艺;应用免疫磁珠富集法河北省首次从食品中检出O157∶H7大肠杆菌[J];疾病监测;2001年06期
6 肖波,彭永,杨欢,谢光洁,侯熙德,李静;急性疱疹病毒性脑炎的治疗[J];脑与神经疾病杂志;1999年01期
7 赵肃清,孙远明,张春艳;甲胺磷单克隆抗体制备及鉴定[J];免疫学杂志;2003年02期
8 唐耀军,尤平涛;单克隆免疫分析法快速检测食品中阿片生物碱[J];宁夏医学杂志;2001年03期
9 田银芳,王翌明;ELISA方法与国标法在检测鲜奶中沙门氏菌的比较研究[J];中国乳品工业;1998年05期
10 韩雪清,刘湘涛,张涌,谢庆阁,田波;猪瘟病毒E2基因在Pichia pastoris中的表达及其免疫活性的初步研究[J];生物工程学报;2002年02期
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中国期刊全文数据库 前4条
1 黄慧珍;程凯;许敏;赵以军;;基于g23基因的武汉东湖T4类浮游病毒遗传多样性[J];中国环境科学;2011年03期
2 吴庶青,侯先志,敖长金,王志新,高峰,苗志国;营养限制对苏尼特母羊血液中胰岛素(Ins)、T_3、T_4浓度的影响[J];黑龙江畜牧兽医;2003年03期
3 曲宪成;杨艳红;刘颖;周正峰;崔严慧;;外源性雌二醇对异育银鲫脑垂体-甲状腺轴的影响[J];南方水产;2007年01期
4 曲宪成;杨艳红;刘颖;周正峰;崔严慧;;外源性皮质醇对异育银鲫TSH-βmRNA表达和血清甲状腺激素水平的影响[J];上海水产大学学报;2007年04期
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1 朱文斌;陈涵强;周进福;王旌;赵红;苏跃青;陈瑶;;TSH与T4联合检测在先天性甲状腺功能低下症筛查中的应用[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
2 王丽梅;高增梁;蒋炎尧;王效贵;;2024-T4铝合金多轴疲劳[A];压力容器先进技术——第七届全国压力容器学术会议论文集[C];2009年
3 邬飞源;金剑;;F_(T3)F_(T4)作为重型肝炎及肝衰竭预后的危险因素分析[A];首届江西省中西医结合肝病学术研讨会、首届江西省中西医结合肝病新进展学习班资料汇编[C];2008年
4 冯星来;陈晓钟;胡福军;秦卫丰;姜峰;李斌;包婺安;王敏华;;T4鼻咽癌介入化疗联合IMRT的临床Ⅱ期研究[A];第六届全国鼻咽癌学术大会论文汇编[C];2010年
5 张振斌;蒋宗勇;林映才;余德谦;郑黎;;超早期断奶应激对仔猪内分泌的影响[A];第三届全国猪营养学术研讨会论文集[C];1999年
6 蔺新英;赵妍;刘建忠;郭冬梅;姜艳艳;;海带有机碘对人甲状腺细胞分泌功能的影响[A];中国营养学会第十次全国营养学术会议暨第七届会员代表大会论文摘要汇编[C];2008年
7 邹晓庭;马玉龙;叶小其;;甜菜碱、碘化酪蛋白对产蛋鸡的作用效果及机理探讨[A];第三届全国饲料营养学术研讨会论文集[C];1998年
8 董莉;姜琳;归绥琪;;补肾解郁清心方对更年期抑郁症大鼠下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响[A];2010全国中西医结合围绝经期专题学术会议论文集[C];2010年
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1 记者 尤志卉;综合数据中心亚洲首家通过T4认证标准[N];苏州日报;2010年
2 《网络世界》记者 鲁媛媛;T4计划[N];网络世界;2011年
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1 王楠;假黑盘菌素和T4溶菌酶微生物高效表达系统的建立[D];中国农业科学院;2010年
2 刘俊杰;中国东北旱地黑土与稻田环境中T4型细菌病毒g23基因多样性研究[D];中国科学院研究生院(东北地理与农业生态研究所);2012年
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1 武玉艳;超高压和热处理对模拟病毒-T4噬菌体的灭活特性研究[D];华南理工大学;2010年
2 刘西永;云南高原湖泊T4类浮游病毒遗传多样性研究[D];华中师范大学;2011年
3 黄慧珍;淡水湖泊T4类浮游病毒遗传多样性研究[D];华中师范大学;2010年
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7 李秀明;生防木霉菌T4和枯草芽孢杆菌B99-2制剂的研制及田间试验[D];华东理工大学;2013年
8 许德荣;T4溶菌酶基因的遗传转化及作为选择标记基因的研究[D];中国林业科学研究院;2010年
9 郑春雨;三江湿地与稻田细菌及T4型细菌病毒多样性比较研究[D];中国科学院研究生院(东北地理与农业生态研究所);2012年
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