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《西北农林科技大学》 2008年
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昆明小鼠胚胎干细胞的分离、培养及鉴定

赵晶  
【摘要】: 本研究的目的是建立有效的昆明小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(ES细胞)的研究,筛选出更适合于昆明小鼠ES细胞的克隆培养体系,为进一步建立昆明小鼠ES细胞系奠定基础。 1.分别选取妊娠11 d,14.5 d和16 d的孕鼠胎儿分离成纤维细胞,比较分离不同日龄胎儿的成纤维细胞增殖及纯化情况,以及观察不同接种密度,成纤维细胞体外培养生长状况。选择成纤维细胞分离培养的最适胚龄和最佳培养条件。试验结果显示,14.5 d的孕鼠胎儿分离培养成纤维细胞效果最好。可分离到大量的成纤维细胞,杂细胞少,并且细胞增殖快。生长旺盛、已纯化的第三代成纤维细胞最适宜做ES细胞的饲养层。 2.采用全胚培养法,比较桑椹胚和囊胚对ES细胞分离培养的影响。将桑椹胚和囊胚分别培养在饲养层上,桑椹胚的贴壁率、内细胞团(ICM)增殖率和ES细胞集落的出现率均显著低于囊胚(P﹤0.01)。由此看出,试验中获得的小鼠囊胚更适合作为ES细胞分离克隆的材料,并且妊娠第4天采集的胚胎囊胚率高。 3.比较三种不同浓度消化液:0.25 %胰酶+0.04 % EDTA,0.05 %胰酶+0.04 % EDTA和0.02 %胰酶+0.01 % EDTA,对内细胞团、ES细胞集落分离克隆的影响。试验结果显示,0.02 %胰酶+0.01 % EDTA是较好的ES细胞消化液,对细胞的损伤力小,且传代后ES细胞集落形成能力也较高;对没有消化离散的大的细胞团块,吸出后用机械法切割。 4.选取生长旺盛并且已纯化的第3代成纤维细胞,经丝裂霉素-C处理后,用细胞计数板计算细胞数,分别按密度为1×104个/mL,1×106个/mL和1×108个/mL接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况和不同密度饲养层上囊胚、内细胞团及胚胎干细胞的克隆生长情况。试验结果表明,囊胚在密度为1×106个/mL的饲养层上,贴壁率和内细胞团孵出率分别为(97.0±3.606) %,(96.3±2.887) %,显著高于其他两组;密度为1×106个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104个/mL(差异极显著,P﹤0.01)和1×108个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异显著(P﹤0.05);而1×104个/mL饲养层和1×108个/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P﹥0.05)。因此,以1×106个/mL密度接种的成纤维细胞作为饲养层,最适合用于分离培养昆明小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育、内细胞团的增殖、促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用。 5.对分离克隆出的ES细胞进行细胞形态、集落形态、碱性磷酸酶测定、核型分析以及体外分化能力加以鉴定。分离得到的ES细胞有典型的形态学特征,集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,其隆起生长,细胞之间界限不清楚;碱性磷酸酶染色呈强阳性,ES细胞集落具有正常的二倍体核型,可形成拟胚体。表明培养扩增后的细胞具有ES细胞的典型特征。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q813

【引证文献】
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