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《西北农林科技大学》 2008年
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长双歧杆菌NCC2705果糖代谢研究

孙忠科  
【摘要】: 长双歧杆菌NCC2705可以利用人体肠道消化残余的单果糖和寡糖,从而扮演“清道夫”的角色。为了更清楚的确定长双歧杆菌NCC2705对果糖的转运、利用和调控的机理,了解其在肠道的适应性,我们采用蛋白质组学和功能基因组学方法对该菌的果糖代谢进行研究。 首先,采用不同pH梯度胶条对生长在添加果糖培养基中的长双歧杆菌NCC2705全菌体蛋白进行双向电泳,利用MALDI-TOF MS鉴定到了双歧杆菌葡萄糖代谢的双歧途径中的所有蛋白酶。这7种蛋白酶在果糖发酵过程中的存在表明,在蛋白质水平上果糖是通过和葡萄糖相同的代谢途径进行降解的。然后,以平行操作的生长在葡萄糖培养基中的该菌蛋白图谱为参考,利用ImageMaster 2D Platinum 5.0软件进行胶上蛋白丰度分析,对在果糖培养基上表达差异三倍以上的点应用质谱鉴定到了18个蛋白。对其中的6个蛋白同时进行半定量RT-PCR验证,确定了其对应的基因BL0033、BL0034、BL0715、BL1339、BL1340和BL1341都定位在染色体上。有趣的是,果糖特异性糖结合蛋白BL0033和可能的果糖激酶Frk(BL1339)都具有高水平表达,并且ESI–MS/MS鉴定到BL0033有五个不同的电荷异构体。 进一步利用不同糖底物浓度、不同发酵时间的比较蛋白质组学和半定量RT-PCR试验研究糖浓度和发酵时间对受诱导或抑制蛋白表达的影响。实验结果显示果糖浓度越高,诱导时间越长,BL0033的表达量越高,说明BL0033是果糖诱导表达的。同时,ABC转运系统的ATP结合蛋白BL0034显示了轻微的上调。以上的结果表明果糖可能是通过BL0033和BL0034共同作用的一个特殊的转运系统——果糖ABC转运系统吸收。为进一步研究这一特殊转运系统,我们将目标基因BL0033克隆到带有His标签的表达载体pET-32a中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。利用纯化蛋白免疫兔子获得蛋白BL0033的多克隆抗体,免疫共沉淀试验揭示了体内环境中可能与BL0033相互作用的蛋白。 以上研究揭示了双歧杆菌果糖转运和同化的一些分子机制,注释了一些未知功能蛋白和调控子,这对解释双歧杆菌在肠道环境中的适应性具有重要的意义。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R151

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