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PRRSV Henan-1株的分离鉴定及其全基因组序列分析

张彩勤  
【摘要】: 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是20世纪80年代末发现的一种高度传染性疾病,引起妊娠母猪的流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍,以及各种年龄猪(特别是仔猪)的呼吸道症状,其病原为猪生殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)。PRRSV基因组长约15 kb,包括8个开放阅读框(ORFs)。 本研究用Marc-145细胞从河南地区发病猪场采集的病料样本中分离到一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),采用RT-PCR方法对分离到毒株进行了初步鉴定,将其在Marc-145细胞上增殖并测定其TCID50。分段设计引物,采用RT-PCR方法分别扩增并克隆此毒株的所有cDNA片段,获得其全基因组序列。将此分离毒株命名为Henan-1。用DNAMAN和DNAStar软件将Henan-1毒株的基因组序列与GenBank中其它国内外分离毒株的已知序列进行相关分析。序列分析表明此分离毒株为美洲型PRRSV。 1.将采集到的肺脏等病料经过研磨、过滤等处理后,接种于状态良好的单层平整的Marc-145细胞,在接种72 h后出现明显的细胞聚集成丛、随后固缩、变圆、脱落等细胞病变,并通过RT-PCR方法确定了病毒在Marc-145细胞上的增殖。将此分离到的PRRSV命名为Henan-1。测定此分离毒株第三代细胞毒的病毒滴度为104.8 TCID50/ml。 2.PRRSV全基因组长15kb,分段设计22对引物,利用分离株的传代细胞毒,通过RT-PCR方法,分段扩增出PRRSV Henan-1的全基因cDNA片段,分别将其克隆到pMD18-T载体中,对鉴定为阳性的重组质粒进行测序,获得Henan-1的全基因组序列。利用DNAMAN和DNAStar软件将Henan-1毒株的全基因组序列与GenBank中其它国内外分离毒株的已知序列进行序列分析,其结果显示Henan-1毒株与国内外各美洲型分离株全序列同源性在88.8%~99.3%,而与欧洲型分离株LV株的差异较大,同源性为50.5%。表明Henan-1为美洲型毒株。Henan-1株与VR-2332毒株相比,存在许多处碱基的变异,其中ORFla编码的聚合蛋白经裂解后产生的其中一个非结构蛋白Nsp2的基因存在30个氨基酸的不连续缺失,因此可能改变了PRRSV对细胞或组织的嗜性,或者Nsp2区域氨基酸的缺失与毒力增强有关系。依据Nsp2核苷酸序列进行了系统进化分析,表明Henan-1与JXA1、HUB2等毒株的遗传关系最近,属于一个新的分支;而CH-1a、PA8、VR-2332等毒株则另属别的分支。


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